版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、第一部分
背景:慢性腦缺血(Chronic cerebral hypoperfusion,CCH)為臨床常見病、多發(fā)病,致死率、致殘率高,可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙,嚴(yán)重危害人類健康。迄今為止,CCH導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)理不完全清楚,尚無特效藥物和治療手段,因此,CCH導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制與防治是神經(jīng)科學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。
CCH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其主要的病理過程包括缺血導(dǎo)致細(xì)胞能量缺失、細(xì)胞壞死和凋亡、腦白質(zhì)損傷、血腦屏障
2、破壞、脂質(zhì)代謝和神經(jīng)血管單元功能紊亂,神經(jīng)發(fā)生受損等。神經(jīng)發(fā)生即新的神經(jīng)元產(chǎn)生的過程,包括神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化,最終新生成的神經(jīng)元并整合到局部神經(jīng)環(huán)路。臨床上中風(fēng)患者數(shù)周至數(shù)月后癥狀有所改善,部分得益于腦部這種內(nèi)在的修復(fù)機(jī)制,因此促進(jìn)腦缺血損傷后的神經(jīng)發(fā)生對其治療有重要意義。當(dāng)腦組織受到損傷或炎癥等刺激時(shí),局部微環(huán)境發(fā)生改變,神經(jīng)干細(xì)胞即被活化,進(jìn)而增殖、遷移、分化產(chǎn)生新的神經(jīng)元,發(fā)揮代償和修復(fù)功能。
眾多因素影響CC
3、H時(shí)的神經(jīng)發(fā)生,其中核受體超家族重要成員——肝X受體(Liver X receptors,LXRs),在神經(jīng)發(fā)生中的地位日益受到關(guān)注。LXRs包括兩種亞型——LXRα和LXRβ。LXRα主要表達(dá)在肝臟、腎臟、小腸、脾臟、脂肪組織等參與外周脂質(zhì)代謝的器官;LXRβ表達(dá)十分廣泛,其中肝臟和大腦的表達(dá)水平最高。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中,LXRs是最主要的維持膽固醇平衡和抗炎的因子。膽固醇代謝失調(diào)參
4、與眾多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病,尤其在CCH發(fā)生發(fā)展的過程扮演重要角色,通過調(diào)節(jié)或糾正脂質(zhì)代謝紊亂,有可能用于CCH的臨床治療。研究表明,LXRα和LXRβ作為抗炎轉(zhuǎn)錄因子,參與先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,亦可作為細(xì)胞凋亡和吞噬的生理調(diào)節(jié)劑。來自細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜破裂的膽固醇衍生物,作為LXRs激動(dòng)劑發(fā)揮抗凋亡的作用。已有研究證實(shí),LXRs受體激動(dòng)劑GW3965可劑量依賴性地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖,提示LXRs可能參與了神經(jīng)發(fā)生,推測可能在改善CC
5、H導(dǎo)致的認(rèn)知障礙中也發(fā)揮著重要的作用。因此,LXRs可能作為CCH潛在的治療新靶點(diǎn)具有非常重要的意義。
目的:以腦內(nèi)LXRs為研究對象,探討LXRs參與CCH的發(fā)病機(jī)制、激活LXRs改善CCH引起的學(xué)習(xí)記憶障礙的分子機(jī)制。擬通過闡明LXRs激動(dòng)劑GW3965提高神經(jīng)元的存活、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,從而改善CCH引起的學(xué)習(xí)記憶障礙的研究機(jī)制。該研究為治療CCH提供新靶點(diǎn),為臨床研究提供思路和理論依據(jù)。
方法:
6、 1.免疫熒光法觀察LXRα、LXRβ在海馬是否有特異性表達(dá)、分布;進(jìn)一步通過LXRβ與神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(NeuN/GFAP)雙標(biāo)共染確定LXRs分布的細(xì)胞特異性,將LXRβ與抑制性/興奮性神經(jīng)元標(biāo)志物(GABA/VGLUT2)雙標(biāo)染色確定表達(dá)的神經(jīng)元類型。
2.微彈簧圈法造成雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄(Bilateral carotid stenosis,BCAS)建立CCH小鼠模型;Morris水迷宮行為學(xué)評價(jià)CCH是否能夠?qū)е?/p>
7、小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙,進(jìn)而給予GW3965治療15d是否可改善CCH導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。
3.給予或不給予GW3965治療,觀察HE染色小鼠的PFC(Prefrontal cortex)、CA1區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)、存活率變化。
4.采用Western blot的方法,檢測CCH模型小鼠PFC、CA1中LXRs不同亞型表達(dá)水平的變化。
5.采用Western blot的方法,檢測該模型小鼠腦內(nèi)谷氨酸離子型受體
8、與凋亡信號通路上相關(guān)蛋白表達(dá)的變化;并觀察給予GW3965治療后是否逆轉(zhuǎn)這些蛋白的表達(dá)。
6.體外培養(yǎng)神經(jīng)元,建立氧糖剝奪模型(OGD)模擬CCH模型,利用MTT檢測不同時(shí)間梯度CoCl2對細(xì)胞存活率的影響,以及給予不同濃度梯度GW3965細(xì)胞存活率的變化。
7.BrdU摻入(100mg/kg i.p,連續(xù)3d)、染色法觀察CCH建模30d小鼠海馬齒狀回(DG)區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的變化,給予GW3965治療CCH小鼠,
9、DG區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的變化。
8.體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,首先采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察LXRα、LXRβ與神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin是否共表達(dá);并觀察給予不同濃度梯度GW3965處理后是否會(huì)濃度依賴性的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
9.設(shè)計(jì)并包裝生產(chǎn)LXRα、LXRβ慢病毒載體(shLXRα、shLXRβ);通過免疫熒光和Western blot驗(yàn)證shLXRα、shLXRβ體外感染神經(jīng)干細(xì)胞的效率及下調(diào)LXRα、LXRβ表達(dá)
10、水平的效果;
10.shLXRα、shLXRβ、shLXRα+shLXRβ分別感染NSCs72h后,給予GW3965處理3d,經(jīng)BrdU(100μg/ml,4h)摻入后免疫熒光染色法分析細(xì)胞增殖的變化,明確GW3965促NSCs增殖效應(yīng)的LXRs受體亞型。
11.為探究PI3K/Akt信號通路在GW3965促NSCs增殖中的作用,首先Western blot法觀察GW3965對NSCs中Akt磷酸化的影響(時(shí)間依賴性
11、和濃度依賴性);進(jìn)而預(yù)先給予PI3K特異性抑制劑LY294002(20μM,2h)處理,觀察GW3965對p-Akt表達(dá)水平的影響;最后,BrdU摻入法分析LY294002對GW3965促NSCs增殖效應(yīng)的影響,明確GW3965是否通過PI3K/Akt信號通路促NSCs增殖效應(yīng)。
結(jié)果:
1.免疫熒光染色結(jié)果顯示,LXRβ海馬區(qū)的表達(dá)多,LXRα在海馬區(qū)表達(dá)較少。
2.Morris水迷宮結(jié)果顯示,與假手術(shù)組
12、相比,CCH導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙,表現(xiàn)為小鼠搜索平臺時(shí)間(潛伏期)延長,游泳距離增加,穿越平臺次數(shù)減少;與模型組相比,GW3965治療后,顯著改善CCH導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。
3.HE染色結(jié)果證實(shí),與假手術(shù)組相比,模型小鼠的PFC、CA1區(qū)域神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)不清晰,出現(xiàn)細(xì)胞核固縮和大量細(xì)胞凋亡;與模型組相比,給予GW3965治療后神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)與正常相似,細(xì)胞凋亡的比例下降。
4.Western blot結(jié)果顯示,與
13、假手術(shù)組相比,CCH模型小鼠PFC、CA1中LXRβ表達(dá)水平顯著下調(diào),LXRα表達(dá)水平的變化不明顯。
5.Western blot結(jié)果表明,與假手術(shù)組相比,CCH模型小鼠海馬中谷氨酸離子型受體——NMDAR的亞基GluN2B表達(dá)水平增加而GluN2A基本不變,AMPAR的GluR1亞基絲氨酸831、845位點(diǎn)磷酸化減少,同時(shí),凋亡信號通路中Bax、PARP表達(dá)增加而Bcl-2表達(dá)下降;給予CCH小鼠GW3965治療后,可以逆轉(zhuǎn)
14、上述這些蛋白表達(dá)的變化。
6.以CoCl2(200μM)孵育培養(yǎng)的神經(jīng)元模擬氧糖剝奪病理?xiàng)l件,MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),CoCl2干預(yù)后神經(jīng)元存活呈時(shí)間依賴性降低,大約50%細(xì)胞于缺氧12h時(shí)死亡;給GW3965處理后發(fā)現(xiàn),GW3965濃度依賴性提高細(xì)胞的存活。
7.采用BrdU摻入免疫熒光染色法分析NSCs的增殖,結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,CCH小鼠DG區(qū)BrdU陽性的NSCs數(shù)目顯著減少,提示CCH中NSCs增殖受損;
15、給予GW3965治療后,與CCH組相比,GW3965恢復(fù)CCH小鼠DG區(qū)NSCs的增殖,提示GW3965具有促NSCs增殖的作用。
8.體外培養(yǎng)NSCs,免疫熒光雙標(biāo)法觀察NSCs中LXRα、LXRβ的表達(dá),發(fā)現(xiàn)LXRα、LXRβ與NSCs標(biāo)志物Nestin共存;給予不同濃度LXRs的激動(dòng)劑GW3965處理,發(fā)現(xiàn)GW3965濃度依賴性的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
9.包裝生產(chǎn)LXRα/LXRβ的慢病毒載體;免疫熒光和Wes
16、tern blot顯示,shLXRα、shLXRβ高效感染神經(jīng)干細(xì)胞,并顯著下調(diào)LXRα、LXRβ表達(dá)水平。
10.分別以shLXRα、shLXRβ感染NSCs下調(diào)蛋白表達(dá)水平,采用BrdU摻入熒光染色法發(fā)現(xiàn),如前給予GW3965處理3d后,shLXRβ轉(zhuǎn)染后GW3965促NSCs增殖效應(yīng)被取消,而shLXRα轉(zhuǎn)染后不影響GW3965促NSCs增殖作用,提示GW3965促NSCs增殖效應(yīng)通過激活LXRβ而非LXRα實(shí)現(xiàn)。
17、> 11.Western blot結(jié)果顯示,GW3965時(shí)間、濃度依賴性增加NSCs中Akt磷酸化水平,其中GW3965刺激NSCs15min(10μM)或10μM(15min)時(shí),Akt的磷酸化即達(dá)高峰;給予NSCs預(yù)處理LY294002(20μM)2h,GW3965磷酸化Akt的效應(yīng)則消失,相應(yīng)的GW3965促NSCs增殖作用亦被取消,提示GW3965促進(jìn)NSCs增殖的效應(yīng)與PI3K/Akt信號通路活化相關(guān)。
結(jié)論:本研
18、究證實(shí),通過微彈簧造成雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄成功建立小鼠CCH模型,CCH導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙;給予CCH小鼠GW3965治療,可改善CCH小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。深入的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),GW3965通過抑制凋亡信號通路提高神經(jīng)元的存活;同時(shí),GW3965通過激活LXRβ,進(jìn)而活化PI3K/Akt信號通路促進(jìn)NSCs增殖參與CCH神經(jīng)發(fā)生。研究結(jié)果提示,激活LXRs提高CCH發(fā)生發(fā)展過程中神經(jīng)元的存活、促進(jìn)NSCs增殖,從而改善CCH導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙
19、。因此,LXRs可能作為CCH潛在的治療新靶點(diǎn)。
第二部分
背景:慢性炎性痛(Chronic inflammatory pain)是一種與組織損傷或潛在的損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情感體驗(yàn),能夠誘發(fā)不良情緒,使患者的病情加重。研究證實(shí),前扣帶皮層(Anterior cingulate cortex,ACC)是大腦的疼痛處理區(qū)之一,是痛覺調(diào)節(jié)的重要組成部分。已證實(shí),慢性痛潛在的機(jī)制包括 ACC區(qū)神經(jīng)元過度興奮以及膠質(zhì)
20、細(xì)胞的激活,其中,膠質(zhì)細(xì)胞的激活導(dǎo)致炎癥的級聯(lián)反應(yīng)是誘發(fā)慢性痛的重要原因。天麻素(Gastrodin,GAS)是從天麻中分離出的主要活性成分之一,具有鎮(zhèn)痛、促智、抗炎作用。因此,GAS可能作為慢性炎性痛潛在的治療藥物具有非常重要的意義。
目的:GAS對改善CFA誘發(fā)慢性炎性痛小鼠行為學(xué)的影響,擬通過闡明GAS改善CFA引起的慢性炎性痛及具有抗焦慮效應(yīng),抑制炎癥信號蛋白的過表達(dá),從而發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用的研究機(jī)制。為臨床治療慢性炎性痛
21、提供思路和理論依據(jù)。
方法:本實(shí)驗(yàn)通過檢測機(jī)械痛閾值與熱痛閾值,觀察給予GAS后CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛小鼠的行為學(xué)變化。高架十字迷宮(Elevated plus-maze test,EPM)和曠場實(shí)驗(yàn)(Open field test,OFT)檢測給予GAS后,慢性炎性痛誘導(dǎo)的焦慮樣行為的改變。免疫熒光觀察小鼠ACC區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況,Western blot觀察ACC區(qū)神經(jīng)可塑性蛋白與炎性相關(guān)的蛋白表達(dá)變化。
22、
結(jié)果:GAS能顯著緩解CFA誘導(dǎo)的小鼠慢性炎性痛和伴隨的焦慮樣行為。GAS治療后,降低CFA小鼠ACC區(qū)NMDAR亞基GluN2A與GluN2B、AMPAR亞基GluR1及CaMKII-α表達(dá)的上調(diào),提示與神經(jīng)可塑性相關(guān)的關(guān)鍵分子參與慢性炎性痛及其伴隨的焦慮樣行為。此外,GAS減少CFA小鼠ACC區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,降低與炎癥相關(guān)信號蛋白p-JNK和p-P38,IL-6和TNF-α的表達(dá),提示GAS可能通過調(diào)控
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 枸杞籽油對慢性應(yīng)激小鼠抑郁樣行為和認(rèn)知障礙的改善作用與機(jī)制研究.pdf
- 小鼠腦缺血神經(jīng)功能障礙行為學(xué)評價(jià)的研究進(jìn)展
- 蝦青素對慢性氧樂果中毒認(rèn)知障礙小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf
- 阿托伐他汀對Aβ小鼠認(rèn)知障礙的作用及其機(jī)制研究.pdf
- 肝X受體β在小鼠炎性疼痛中的作用及機(jī)制研究.pdf
- 補(bǔ)腎活血方對血管性癡呆小鼠行為學(xué)的改善作用及其機(jī)制研究.pdf
- 靛藍(lán)對小鼠炎性痛的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制研究.pdf
- 電針調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)對慢性腦缺血大鼠大腦血管新生及認(rèn)知行為學(xué)的影響.pdf
- 文冠果柄苷對腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用.pdf
- 急性應(yīng)激對小鼠行為學(xué)改變和血清CREB表達(dá)的影響.pdf
- 神經(jīng)調(diào)節(jié)素對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用和機(jī)制.pdf
- 慢性腦缺血大鼠認(rèn)知障礙與甲狀腺激素系統(tǒng)關(guān)系.pdf
- 補(bǔ)腎活血法對AD模型小鼠行為學(xué)的影響及其作用機(jī)制研究.pdf
- AnkG對小鼠精神行為和認(rèn)知功能的影響及機(jī)制探討.pdf
- 藏醫(yī)名方聯(lián)用對腦缺血損傷及行為學(xué)障礙的藥效學(xué)研究.pdf
- 二氫楊梅素對小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的抗炎抗凋亡機(jī)制研究.pdf
- 經(jīng)鼻rhEPO對慢性腦缺血大鼠行為學(xué)及神經(jīng)元凋亡的影響.pdf
- 吲哚胺2,3-二加氧酶抑制劑對慢性腦低灌注致認(rèn)知障礙大鼠行為學(xué)的改善作用.pdf
- 地黃梓醇抗腦缺血并改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及機(jī)制研究.pdf
- 冬蟲夏草素對小鼠腦缺血復(fù)灌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf
評論
0/150
提交評論