伏隔核miR-382及AKT3對線索誘導海洛因復吸的作用.pdf

1、目的：阿片類藥物成癮已成為我國公共衛(wèi)生健康中重大社會問題之一。目前臨床治療藥物成癮的最大難點是成癮患者的心理渴求和藥物復吸行為。研究發(fā)現(xiàn)藥物成癮的主要病理生理機制是腦內神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質細胞中的基因和蛋白表達產(chǎn)生適應性改變。最近發(fā)現(xiàn)，miRNA主要在轉錄后水平調控靶基因的表達，與藥物成癮關系密切。但缺少miRNA在海洛因成癮復吸中的作用機制研究。本課題旨在研究大鼠海洛因成癮及戒斷線索誘導復吸后伏隔核的miRNA表達譜變化，選擇miR-

2、382作為研究對象，對其生物學功能進行系統(tǒng)的探索。
　　實驗一、依據(jù)芯片分析結果對 miR-382表達進行驗證
　　方法：雄性 SD大鼠經(jīng)海洛因自身給藥訓練成癮后備用，實驗分三組：空白對照組（Control，n=6），海洛因成癮大鼠隨機分成兩組：戒斷第一天線索誘導復吸組（CS1，n=6）和戒斷14天線索誘導復吸組(CS14,n=6)。Control組與CS1組大鼠于海洛因戒斷第一天斷頭取伏隔核，CS14組大鼠于戒斷14天后斷

3、頭取伏隔核，運用 RT-PCR實驗技術檢測 miR-382的表達變化是否與芯片一致
　　結果：三組大鼠伏隔核經(jīng) RT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，CS1組大鼠伏隔核 miR-382的表達顯著增加[t(4)=5.185,p<0.05]。與 CS1組比較，大鼠戒斷14天后 miR-382的表達顯著減低[t(4)=6.448,p<0.05]。本次實驗結果與芯片結果相一致。
　　實驗二通過雙熒光素酶實驗檢測 miR-382對

4、 AKT3基因表達的作用
　　方法：將 AKT3基因的熒光質粒（AKT3WT，AKT3mutant，control）0.1μg，miRNA-382質粒（miRNA-382和 miRNA-382 NC）0.4μg，Renilla質粒0.02μg通過 X-tremegene HP（ROCHE）試劑盒，在24孔板，500μL/well，共轉染于293T細胞。實驗分六組：control+miRNA-382，control+ miRNA-3

5、82-NC，AKT3WT+ miRNA-382，AKT3WT+ miRNA-382-NC，AKT3 MU+ miRNA-382，AKT3 MU+ miRNA-382-NC)，轉染48h后使用 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)檢測各組熒光表達值。觀察 miR-382對 AKT3WT組熒光蛋白的表達作用。
　　結果：AKT3WT+miRNA-382組的熒光表達量顯著低于 AK

6、T3WT+miRNA-382-NC[t(4)=34.77,p<0.05]和 AKT3mutant+miRNA-382組[t(4)=14.7，p<0.05]。結果提示 miR-382通過與 AKT3mRNA堿基互補配對抑制 AKT3基因的表達。
　　實驗三觀察大鼠戒斷14天后線索誘復吸對 AKT3蛋白表達的影響
　　方法：實驗分兩組：空白對照組（control,n=6）及戒斷14天后線索誘導復吸組（CS14,n=6）,將兩組大

7、鼠麻醉后斷頭取腦，取伏隔核，運用 RT-PCR及Western blot檢測兩組伏隔核 AKT3mRNA和 AKT3蛋白的表達變化。
　　結果：兩組大鼠斷頭取伏隔核，經(jīng) Western blot實驗及 RT-PCR實驗檢測后，與空白對照組比較，發(fā)現(xiàn) AKT3蛋白[t(6)=3.92，p<0.05]及AKT3mRNA[t(4)=13.86，p<0.05]在 CS14組表達顯著增高。結果說明，AKT3基因在線索誘導的大鼠海洛因復吸過程

8、發(fā)揮了重要的作用。
　　實驗四觀察伏隔核高表達 miR-382對線索誘導的大鼠海洛因復吸行為作用并對 AKT3蛋白表達進行分析
　　方法：將成功建立海洛因成癮的大鼠隨機分成三組，戒斷14天后線索誘導復吸組（CS14，n=8），陰性病毒組（LV-GFP,n=10），miR-382表達組（LV-miR-382,n=8），三組大鼠有效鼻觸無顯著差異，LV-GFP組和 LV-miR-382組于戒斷第一天通過腦立體定位，在伏隔核注入相

9、應慢病毒。三組大鼠于戒斷14天后進行2小時線索誘導復吸測試，檢測 miR-382高表達后對線索誘導的海洛因復吸行為的作用，然后斷頭取伏隔核，分別行 RT-PCR實驗檢測 miR-382及AKT3mRNA表達，和 Western blot實驗檢測 AKT3蛋白的表達。
　　結果：通過 RT-PCR實驗技術檢測發(fā)現(xiàn)，與 LV-GFP組比較，LV-miR-382組大鼠 miR-382在伏隔核成功過表達[t(7)=2.45,p<0.05]

10、，并顯著抑制該組大鼠線索誘導的海洛因復吸行為[t(16)=2.56,p<0.05]，AKT3蛋白在伏隔核表達顯著性減低[t(4)=2.92,p<0.05]，但各組間 AKT3mRNA的表達未見明顯差異(p>0.05)。結果提示，在伏隔核高表達 miR-382可顯著抑制線索誘導的海洛因復吸行為，并抑制 AKT3蛋白的表達，但不引起 AKT3mRNA的降解。
　　實驗五伏隔核注射 AKT3siRNA對大鼠海洛因成癮復吸行為的作用并對

11、AKT3蛋白的表達進行分析
　　方法：將成功建立海洛因成癮的大鼠隨機分成三組，戒斷14天后線索誘導復吸組（CS14，n=9），陰性病毒組（LV-GFP,n=9），AKT3表達抑制組（LV-siRNA-AKT3,n=9），三組大鼠有效鼻觸無顯著差異，LV-GFP組和 LV-siRNA-AKT3組于戒斷第一天通過腦立體定位，在伏隔核注入相應慢病毒。三組大鼠于戒斷14天后進行2小時線索誘導海洛因復吸測試，斷頭取伏隔核檢測 AKT3蛋白表

12、達，分別進行 RT-PCR實驗檢 AKT3mRNA表達和 Western blot實驗檢測AKT3蛋白的表達。
　　結果：與LV-GFP組比較，LV-AKT3-siRNA組大鼠伏隔核注射 AKT3siRNA后顯著抑制線索誘導海洛因復吸行為[t(16)=2.939,p<0.05]。AKT3蛋白的表達顯著減低[t(8)=3.69,p<0.05]，AKT3mRNA表達顯著抑制[t(10)=2.86,p<0.05]。實驗結果表明，大鼠海洛

13、因成癮后降低伏隔核 AKT3蛋白的表達可顯著抑制線索誘導的海洛因復吸行為。
　　結論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)大鼠海洛因成癮戒斷后 miR-382在伏隔核中的表達降低，升高miRNA-382在伏隔核表達可抑制線索誘導的海洛因復吸行為。而后運用熒光雙素酶實驗驗證和在體實驗證明 AKT3為 miRNA-382作用的靶基因。同時又通過減低AKT3在伏隔核表達可抑制線索誘導的海洛因復吸行為。綜上述研究結果表明：伏隔核 miRNA-382對