ADK沉默的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠癲癇及相關(guān)認(rèn)知障礙的研究.pdf

1、第一部分RNA干擾下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中腺苷激酶的研究
　　目的：
　　本部分研究旨在通過攜帶RNA干擾（RNAi）的慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，探討其對腺苷激酶（ADK）的干擾作用，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供研究工具。
　　方法:
　　體外分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)，攜帶ADK相關(guān)RNAi（P236）的慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs，根據(jù)GFP表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)確定慢病毒轉(zhuǎn)染的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）,以對照病毒轉(zhuǎn)染的

2、MSCs作為對照，通過免疫熒光和western blot定性定量分析RNA干擾引起的MSCs中ADK含量的變化，并用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒分析腺苷含量變化。
　　結(jié)果:
　　全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲得的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)且均一，呈長梭形，雜質(zhì)細(xì)胞少，活性佳。慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最適感染復(fù)數(shù)為30，感染效率為93.6±4.2％。western blot顯示：與對照組相比，RNAi（P236）可以使腺苷激酶的表

3、達(dá)下降53%，免疫熒光檢測進(jìn)一步表明也RNAi可以下調(diào)腺苷激酶的表達(dá)。利用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒分析105個(gè)ADK下調(diào)的MSCs孵育8小時(shí)每毫升培養(yǎng)液增加13.8 ng腺苷。
　　結(jié)論：
　　RNA干擾（p236）可有效沉默大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中腺苷激酶的表達(dá)，并使腺苷含量增加。
　　第二部分：ADK沉默的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在鋰-匹羅卡品癲癇模型中的抗癲癇作用和神經(jīng)保護(hù)作用
　　目的：
　　本研究探討腺

4、苷激酶的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在鋰-匹羅卡品癲癇模型中的抗癲癇作用和神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法:
　　慢病毒攜帶的綠色熒光蛋白基因標(biāo)記MSCs，分別將ADK--MSCs和control-MSCs移植到成年SD大鼠雙側(cè)海馬，移植一周后腹腔注射匹羅卡品制作癲癇模型，隨機(jī)選取移植ADK--MSCs的大鼠中的一部分每天接受腺苷A1受體拮抗劑DPCPX注射并維持整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。其后分別于造模急性期（1天）、慢性期（30天）進(jìn)行行為學(xué)（造模時(shí)

5、癲癇發(fā)作情況、自發(fā)性癲癇發(fā)作頻率監(jiān)測）、電生理（EEG）以及免疫組織化學(xué)（冰凍切片尼氏染色、TUNEL染色）研究大鼠癲癇發(fā)作情況、腦電圖變化和海馬神經(jīng)元變化。
　　結(jié)果:
　　匹羅卡品誘發(fā)了control-MSCs移植大鼠的癲癇持續(xù)狀態(tài)和隨后的自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作以及海馬神經(jīng)元凋亡和丟失。ADK基因沉默的MSCs移植減少了癲癇持續(xù)狀態(tài)半小時(shí)內(nèi)V級發(fā)作的總時(shí)間并減少了后期的自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作次數(shù)及癲癇波的頻率；造模后一天，TUN

6、EL染色示陽性細(xì)胞數(shù)減少、western blot示caspase-3活性降低，造模后30天尼氏染色示海馬神經(jīng)元丟失程度減少了33％。而接受DPCPX的ADK—MSCs移植組沒有這些改善。
　　結(jié)論：
　　腺苷激酶基因沉默的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可阻礙大鼠癲癇自發(fā)性發(fā)作的發(fā)生發(fā)展以及改善海馬神經(jīng)元損傷,而這種治療作用是由于移植細(xì)胞釋放的腺苷激活A(yù)1R。
　　第三部分A DK沉默的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植改善鋰-匹羅卡品癲癇大

7、鼠認(rèn)知損害的研究
　　目的:
　　評價(jià)匹羅卡品誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型認(rèn)知功能，研究ADK沉默的細(xì)胞移植對此癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響。
　　方法:
　　分別將ADK--MSCs和control-MSCs移植到成年SD大鼠雙側(cè)海馬，移植一周后腹腔注射匹羅卡品制作癲癇模型，隨機(jī)選取移植ADK--MSCs的大鼠中的一部分每天接受腺苷A1受體拮抗劑DPCPX注射并維持整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。其后于造模后4周進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)和新物辨認(rèn)實(shí)驗(yàn)

8、來評估ADK沉默的細(xì)胞移植對鋰-匹羅卡品癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響。
　　結(jié)果:
　　在連續(xù)5天的水迷宮訓(xùn)練中,隨著訓(xùn)練時(shí)間延長,正常大鼠尋找水下隱匿平臺(tái)的策略逐漸完善，找到水下隱匿平臺(tái)的時(shí)間（逃逸潛伏期）逐漸縮短，而癲癇大鼠表現(xiàn)出學(xué)習(xí)能力下降。與TLE-cont和SHAM組相比，ADK沉默MSCs移植組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物逃逸潛伏期明顯縮短，能更快地找到逃生平臺(tái)，學(xué)習(xí)能力更強(qiáng),接近于未造模正常大鼠的水平;空間探索實(shí)驗(yàn)中，相比TLE-con

9、t和SHAM組大鼠, ADK--MSCs組大鼠穿梭平臺(tái)的次數(shù)更多,然而ADK沉默MSCs移植后接受注射腺苷A1受體拮抗劑（DPCPX）組大鼠沒有此變化。新物辨認(rèn)實(shí)驗(yàn)中,相比未造模的正常大鼠，TLE大鼠對新物體探索的相對時(shí)間減少，而ADK-MSCs移植可改善這種減少，接受DPCPX后這種改善消失。對新物體探索的頻率與對新物體探索的時(shí)間具有相似趨勢，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇大鼠存在認(rèn)知功