穩(wěn)定表達(dá)pAcGFP1-Actin蛋白PC12細(xì)胞系的建立及在細(xì)胞骨架研究中的應(yīng)用.pdf

1、PC12細(xì)胞系克隆于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，它在神經(jīng)生長因子（NGF）的誘導(dǎo)下，能夠向神經(jīng)元細(xì)胞方向分化，并具有神經(jīng)元細(xì)胞的很多生理特征，因此PC12細(xì)胞作為一種模型細(xì)胞被廣泛使用。本論文目的是建立能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP-Actin融合蛋白的PC12細(xì)胞系，并在此基礎(chǔ)上初步探究外界物理刺激和脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞骨架的影響。Actin蛋白作為細(xì)胞骨架的基本組成單位，在細(xì)胞骨架的建立、重構(gòu)以及細(xì)胞遷移等正常生理活動(dòng)中有重要作用，對(duì)Actin蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記就可

2、以對(duì)PC12細(xì)胞骨架進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，而綠色熒光蛋白（GFP）能夠在很多不同的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，其發(fā)出的熒光穩(wěn)定，不易淬滅，在細(xì)胞中表達(dá)對(duì)細(xì)胞沒有毒性，被廣泛的用于細(xì)胞內(nèi)熒光觀察。因此，建立能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP-Actin融合蛋白的細(xì)胞系就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)PC12細(xì)胞骨架的實(shí)時(shí)觀察。
　　 本研究使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有pAcGFP1-Actin基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒載體導(dǎo)入PC12細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)使用陽離子聚合物為載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，以比較兩種介導(dǎo)材

3、料的效率高低。通過G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)pAcGFP1-Actin融合蛋白的PC12細(xì)胞系。在這個(gè)基礎(chǔ)上，初步探究生物相容性材料脂質(zhì)體對(duì)PC12細(xì)胞的微絲性骨架的影響以及AFM針尖對(duì)PC12細(xì)胞骨架局部刺激后細(xì)胞骨架的變化。本論文的主要研究工作分為三部分：
　　 首先，利用脂質(zhì)體和陽離子聚合物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有pAcGFP1-Actin基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入正常的PC12細(xì)胞，并比較兩種載體的轉(zhuǎn)染效率。使用G418

4、篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)pAcGFP1-Actin蛋白的PC12細(xì)胞系。
　　 其次，用乙醇注入法制備脂質(zhì)體，用不同濃度的脂質(zhì)體溶液與PCl2細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在脂質(zhì)體存在的條件下細(xì)胞骨架的變化，從而評(píng)估脂質(zhì)體對(duì)PC12細(xì)胞骨架的影響。
　　 最后，利用原子力顯微鏡的針尖對(duì)PC12細(xì)胞表面進(jìn)行局部物理刺激，用熒光倒置顯微鏡實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞骨架的修復(fù)情況。
　　 使用陽離子聚合物和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，都成功的構(gòu)建了穩(wěn)定表