GPR30在小鼠海馬的表達及對actin細胞骨架重塑的調(diào)控與機制的初步研究.pdf

1、阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease)簡稱AD，是一種逐漸進展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年癡呆最常見的類型，占所有癡呆病例的50％到75%。臨床上主要以記憶障礙、失語、失認、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆特征。由于起病緩慢或隱匿，至今還未發(fā)現(xiàn)有效的治療措施。據(jù)統(tǒng)計，2015年全球癡呆患者人數(shù)已達4680萬人，其中50%-75%為阿爾茨海默病患者。目前，中國阿爾茨海默病患者人數(shù)已居世界第一。而全

2、球癡呆患者每20年增加一倍，預計到2050年將達到1.31億人。目前，老年癡呆已經(jīng)成為老齡化社會主要致死和致殘的疾病之一，給家庭和社會帶來了沉重的負擔。
　　眾多研究發(fā)現(xiàn)，老年癡呆患者中，女性多于男性，呈3:1的發(fā)病幾率并且多見于絕經(jīng)后的女性。因此，老化導致的卵巢雌激素下降被認為是老年癡呆患病的主要原因之一。腦內(nèi)雌激素有兩條來源途徑，一是源于卵巢的循環(huán)雌激素，另外一條是腦內(nèi)的雄激素經(jīng)芳香化酶催化轉(zhuǎn)化而來的雌激素即腦源性雌激素。海馬

3、是腦內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)，與學習記憶與認知密切相關(guān)。大量文獻證實循環(huán)雌激素具有強大的神經(jīng)保護作用，而且雌激素能夠明顯改善認知記憶，因此雌激素替代已經(jīng)用于臨床試驗，但其有無療效與副作用尚不明確，其調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性的機制尚不清楚。前人和課題組既往研究均證實海馬有較高水平的芳香化酶表達，且海馬源性雌激素對海馬的結(jié)構(gòu)和功能也具有重要的調(diào)節(jié)作用，然而其具體調(diào)節(jié)機制同樣不清楚。
　　突觸可塑性包括突觸形態(tài)的可塑性(突觸形態(tài)、密度以及樹突棘密度等)是

4、學習記憶的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除能導致海馬突觸密度和樹突棘密度顯著下降且雌激素替代可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，表明卵巢雌激素可調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞骨架。我們近期工作發(fā)現(xiàn)用芳香化酶抑制劑來曲唑處理能抑制海馬CA1突觸密度以及突觸后膜厚度顯著下降，提示海馬源性雌激素也參與了對細胞骨架重塑的調(diào)節(jié)。然而，兩種來源的雌激素是如何調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元細胞骨架？對此問題目前尚未見文獻報道。
　　眾所周知，actin是最重要的細胞骨架蛋白之一，對細胞形態(tài)的可塑性與維持極

5、為重要。單體球狀肌動蛋(G-actin)與聚合態(tài)的纖維肌動蛋白(F-actin)的動態(tài)變化是突觸可塑性的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)Profilin和 Jasplakinolide(海綿 Jaspis johnstoni的大環(huán)肽天然產(chǎn)物，JPK)可以促進G-actin聚合為F-actin，而cofilin和細胞松弛素 D(CytoD)則可以促進 F-actin解聚為 G-actin。Rictor(rapamycin-insensitive compa

6、nion of mTOR)是不依賴雷帕霉素的雷帕霉素哺乳動物靶蛋白復合體2(mTORC2)的核心成分。研究發(fā)現(xiàn)Rictor對actin細胞骨架的動態(tài)變化具有重要的調(diào)節(jié)作用，其通過磷酸化AKT促進actin的聚合是短時記憶能夠得以鞏固并轉(zhuǎn)變?yōu)殚L時記憶的關(guān)鍵。已有研究經(jīng)發(fā)現(xiàn)雌激素在外周組織中以及海馬神經(jīng)元中均可以調(diào)節(jié)細胞骨架的聚合，然而其具體機制尚不明確。
　　雌激素可以通過兩條途徑發(fā)揮其作用。經(jīng)典的作用方式為雌激素與其核受體(ERα

7、和ERβ)結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的效應，另外一種是雌激素與其膜受體結(jié)合發(fā)揮其快速的非基因調(diào)控效應。GPR30(G Protein-coupled Receptor30)或GPER(G Protein-coupled Estrogen Receptor)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，是近年來新發(fā)現(xiàn)的雌激素膜受體，雌激素與其結(jié)合之后能夠啟動胞外第二信使途徑發(fā)揮快速的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素膜受體GPR30廣泛表達于海馬并且能夠調(diào)節(jié)突觸蛋白的表達

8、進而在學習記憶中發(fā)揮作用，但其是否介導了雌激素對海馬神經(jīng)元actin細胞骨架的調(diào)節(jié)以及具體的調(diào)節(jié)機制目前還不清楚。為了探究GPR30調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元actin細胞骨架的具體機制，在本課題進行了以下實驗研究：
　　1.用免疫組化(IHC)和免疫印跡(Western blot,WB)檢測了生后到成年時期以及卵巢切除和來曲唑處理后海馬GPR30以及actin細胞骨架聚合蛋白Profilin-1的表達變化；
　　2.采用卵巢切除(OV

9、X)、OVX+GPR30激動劑G1以及GPR30拮抗劑G15等方法處理小鼠，然后用Morris水迷宮方法檢測了動物學習記憶行為的變化、用高爾基鍍銀染色法檢測了海馬樹突棘密度的變化；用WB檢測了海馬雌激素核受體及其輔助活化因子SRC-1、Rictor及其下游效應分子AKT、actin細胞骨架聚合調(diào)節(jié)蛋白Profilin-1和cofilin、重要突觸蛋白PSD95與GluR1等分子表達的變化以及F-actin/G-actin比例的變化。

10、r>　　3.利用mHippoE-14海馬神經(jīng)元細胞株，單獨或聯(lián)合應用G1、G15、SRC-1特異性抑制劑蟾毒靈(Bufalin,Bu)、PI3K抑制劑渥曼青霉素(Wortmannin,WM)、JPK和CytoD處理，然后檢測actin細胞骨架聚合調(diào)節(jié)蛋白以及突觸蛋白的表達變化。
　　主要實驗結(jié)果：
　　1. GPR30在生后( P0-P56)小鼠海馬的表達隨發(fā)育水平呈逐漸遞增的趨勢。其中， P0的表達量最低，P56的表達量最

11、高。OVX和LET處理一周均能顯著下調(diào)海馬GPR30的表達。Profilin-1的變化與此類似。此外，OVX和LET能顯著下調(diào)actin聚合蛋白Profilin-1的表達并顯著抑制actin的聚合(F-actin/G-actin比例顯著下降)。
　　2. OVX能誘導小鼠明顯的學習記憶下降，顯著下調(diào)樹突棘密度、雌激素核受體以及SRC-1、突觸蛋白、Rictor、細胞骨架聚合調(diào)節(jié)蛋白的表達以及F-actin/G-actin的比值。G

12、PR30激動劑G1能逆轉(zhuǎn)OVX所致的學習記憶行為下降以及上述分子表達的下降。GPR30抑制劑G15則能模擬OVX的上述效應。
　　3.離體實驗中，G1能顯著上調(diào)細胞骨架聚合蛋白、Rictor、SRC-1和突觸蛋白的表達，而G15能明顯抑制上述分子的表達；SRC-1抑制劑蟾毒靈Bu與G1聯(lián)合處理能拮抗G1的激動效應，WM與G1聯(lián)合處理后G1的激動效應也被拮抗；JPK對細胞骨架聚合和突觸蛋白表達的促進效應能夠被G15所抑制，而G1對a

13、ctin聚合以及突觸蛋白表達的促進作用能被CytoD所阻斷。
　　主要結(jié)論：
　　1.從生后到成年，海馬GPR30和actin聚合蛋白Profilin-1的表達隨發(fā)育水平呈逐漸遞增且均受卵巢雌激素和海馬源性雌激素的調(diào)節(jié)，提示GPR30可能參與了雌激素對海馬actin細胞骨架的調(diào)節(jié)。
　　2.卵巢去勢顯著抑制細胞骨架聚合并導致樹突棘密度的下降以及學習記憶下降，G1和G15分別能逆轉(zhuǎn)或模擬卵巢去勢所導致的上述效應，證實GP