載脂蛋白M-1-磷酸鞘氨醇軸在巨噬細胞炎癥中的作用.pdf

1、目的：明確載脂蛋白M（apolipoprotein M，apoM）在外周血細胞表面的表達情況，探討apoM在炎癥中的作用及可能機制。
　　方法：采集健康成年志愿者新鮮全血，經(jīng)淋巴細胞分離液分離后，CD3、CD19、CD14、CD56和CD16抗體分別標記T細胞、B細胞、單核細胞、NK細胞，用藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）標記apoM，流式細胞儀及激光共聚焦分別檢測不同細胞亞群上apoM蛋白的表達情況。
　　

2、以人單核細胞THP-1細胞為研究對象，體外構(gòu)建巨噬細胞炎癥模型。實驗分組：（1）對照組；（2）10μg/ml人重組apoM蛋白單獨預(yù)處理3h；（3）10μg/ml人重組apoM蛋白預(yù)處理細胞3h，10ng/ml脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）孵育6h；（4）10ng/mlLPS孵育6h。雙重?zé)晒舛縋CR法（dual fluorescent quantitative real-time PCR）檢測腫瘤壞死因子（T

3、umor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素1β（Interleukin1 beta，IL-1β）的mRNA水平。
　　用1-磷酸鞘氨醇受體2（Sphingosine1 Phosphatereceptor2，S1P2）拮抗劑JTE-013（30μM）、激動劑CYM-5520（1μM、10μM、50μM）和S1P1、S1P3、S1P4、S1P5激動劑FTY720（10μM）分別預(yù)處理巨噬細胞0.5h，再用人重組

4、apoM蛋白孵育9h，采用雙重?zé)晒舛縋CR法檢測TNF-α和IL-1β的mRNA水平。
　　結(jié)果：激光共聚焦結(jié)果顯示，T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞表面均表達apoM蛋白。流式細胞檢測結(jié)果顯示，apoM在CD14+單核細胞上表達的比例最高，達到14.4％，其次為CD3+T細胞，表達比例為7.4％，CD19+B細胞、CD56+NK細胞和CD16+NK細胞表達apoM的比例分別為6.2％、2.4％和4.2％。
　　LPS刺

5、激巨噬細胞可顯著上調(diào)TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平，人重組apoM蛋白和LPS共同處理組TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平與LPS單獨刺激組相比分別升高1.15和1.21倍（P值分別為0.0383和0.0034）。
　　在體外，apoM重組蛋白單獨作用可顯著上調(diào)巨噬細胞中TNF-α和IL-1β的mRNA的表達（分別升高2.09倍和1.35倍，P值為0.0007和0.0026）。JTE-013和apoM重組蛋白共同處

6、理組與單獨apoM重組蛋白處理組相比，TNF-α和IL-1β的mRNA水平升高1.86和1.65倍（P值均小于0.0001），CYM-5520和apoM重組蛋白共同處理組與apoM單獨處理組相比，TNF-α和 IL-1β的表達顯著降低（分別降低1.41和1.24倍，P值為0.0406和0.0275）。雙因素方差分析顯示apoM和JTE-013對巨噬細胞TNF-α、IL-1βmRNA表達水平的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。FTY7

7、20和apoM重組蛋白共同作用也能顯著抑制巨噬細胞TNF-α、IL-1βmRNA表達（分別降低1.48和1.6倍，P值均小于0.0001），但雙因素方差分析顯示apoM和FTY720對巨噬細胞TNF-α、IL-1βmRNA表達水平的交互作用沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：健康人外周血單個核細胞中，T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞都表達apoM蛋白，單核細胞表達量最高。人重組apoM蛋白能夠促進LPS介導(dǎo)的巨噬細胞TN