JAK-STAT通路在1-磷酸鞘氨醇后適應減輕心肌細胞缺氧-復氧損傷中的作用.pdf

1、目的：
　　研究Janus激酶及信號轉導和轉錄激活子（JAK-STAT）信號通路在1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）后適應減輕H9c2心肌細胞缺氧/復氧（H/R）損傷中的作用以及保護機制。
　　方法：
　　1.大鼠H9c2心肌細胞的缺氧/復氧模型的建立：
　　培養(yǎng)H9c2細胞需用含有10％ FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液傾掉，換用缺氧液，在缺氧裝置中

2、缺氧培養(yǎng)16 h，之后換成無FBS的DMEM培養(yǎng)基，復氧條件下培養(yǎng)4 h。
　　2.將大鼠H9c2心肌細胞隨機分為7組：
　?。?）正常對照組（C組）；（2）缺氧/復氧（H/R）組；（3）S1P組；（4） S1P+AG組；（5）AG組；（6）S1P+ST組；（7）ST組。C組在正常培養(yǎng)后，換成無FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基；H/R組在缺氧裝置中用缺氧液培養(yǎng)16 h，然后換成DMEM培養(yǎng)基復氧培養(yǎng)4 h；S1P組在復氧時加入終濃

3、度為4μM的S1P的DMEM培基培養(yǎng)4 h；S1P+AG組在復氧前30 min時先加入終濃度為20μM的AG490（JAK2抑制劑）預處理，之后再換成含AG490和S1P的DMEM培基復氧培養(yǎng)4 h；AG組在復氧時加入20μM的AG490復氧培養(yǎng)4 h；S1P+ST組復氧前30 min時先加入終濃度為1μM的stattic（STAT3抑制劑）預處理，之后再換成含stattic和S1P的DMEM培基復氧培養(yǎng)4 h；ST組在復氧時加入1μM

4、stattic復氧培養(yǎng)4 h。
　　3.測定指標：
　　1)通過MTT法檢測各組細胞存活率；
　　2)用微板法測定細胞培養(yǎng)液中總超氧化物歧化酶（T-SOD）和錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活力；
　　3)檢測各組細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活力；
　　4)通過JC-1檢測線粒體膜電位；
　　5)用Fluo-3 AM探針標記細胞鈣離子，激光共聚焦顯微鏡檢測鈣離子熒光強度；
　　6)采用Ann

5、exin V-FITC/PI雙染法，流式細胞儀分析各組細胞凋亡率；
　　7)采用caspase3試劑盒和酶標法檢測各組細胞中caspase3活力；
　　8)Western Blot法分析各組細胞JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平和總蛋白的表達水平。
　　9)利用細胞線粒體分離試劑盒和Western Blot法測定各組中胞漿細胞色素C和線粒體中細胞色素C含量。
　　結果：
　　1. MTT測定細胞存活率

6、r>　　與C組相比，H/R組細胞存活率明顯降低。S1P處理后，細胞存活率顯著提高。而AG490或stattic后可抑制S1P升高細胞存活率作用。
　　2.細胞培養(yǎng)液中SOD活力
　　經H/R處理，細胞培養(yǎng)液中的T-SOD及Mn-SOD活力與C組相比明顯下降。S1P可明顯提高T-SOD及Mn-SOD活力， AG490或stattic預處理可減弱S1P對T-SOD及Mn-SOD活力的升高作用。
　　3.細胞培養(yǎng)液中LDH活

7、力
　　缺氧復氧處理可明顯增加細胞培養(yǎng)液中的LDH活力，與C組比較有顯著性差異。而S1P可明顯降低缺氧復氧損傷時增加的LDH活力。AG490或stattic預處理可抑制S1P對LDH活力的降低作用。
　　4. JC-1檢測線粒體膜電位變化
　　與C組相比，H/R組可顯著增加綠/紅熒光比值，表明H/R損傷可使線粒體膜電位明顯降低；S1P處理使H/R組增加的綠/紅熒光比值明顯降低。加入AG490或stattic后，S1P組

8、升高綠/紅熒光比值的作用得到明顯抑制。
　　5.激光共聚焦顯微鏡測定細胞內游離鈣離子
　　鈣離子的熒光強度維持在8.895?1.079水平，經過H/R損傷后，細胞內鈣離子的熒光強度明顯增強，與C組相比，有顯著性差異；經過S1P處理后，細胞內鈣離子的熒光強度明顯降低；加入AG490以后，細胞內鈣離子的熒光強度明顯增強。同樣加入stattic后，細胞內鈣離子的熒光強度亦明顯增強。
　　6.流式細胞儀檢測細胞凋亡率
　

9、　C組細胞凋亡率較低，與C組相比，H/R組細胞凋亡率顯著增加；經過S1P處理后的細胞凋亡率，與H/R組相比顯著下降；與S1P組相比，加入AG490以后，細胞凋亡率明顯升高。同樣地，加入stattic以后，細胞凋亡率亦明顯增加，且與S1P組相比，有顯著性差異。
　　7.各組細胞caspase3活力的測定
　　與C組相比，H/R組細胞caspase3活力明顯增加。S1P處理后，caspase3活力顯著降低。AG490或statt

10、ic處理后可抑制S1P減弱caspase3活力的作用。
　　8.Western Blot法測定各組細胞蛋白表達變化
　　1) S1P、AG490對H/R損傷后H9c2細胞p-JAK2和t-JAK2蛋白表達的影響
　　與C組相比，H/R處理能使p-JAK2蛋白表達明顯增加；與H/R組相比，S1P組能明顯增加p-JAK2蛋白的表達；加入AG490后，S1P組增加p-JAK2蛋白表達量的作用被顯著抑制了。
　　2) S

11、1P、AG490對H/R損傷后H9c2細胞p-STAT3和t-STAT3蛋白表達的影響
　　H/R損傷后，p-STAT3蛋白表達量比C組有所增加；S1P給藥后，與H/R組比較，能明顯增加p-STAT3蛋白的表達；與S1P組相比， AG490處理能顯著抑制p-STAT3蛋白的表達。
　　3) S1P、stattic對H/R損傷后H9c2細胞p-STAT3和t-STAT3蛋白表達的影響
　　H/R損傷后，p-STAT3蛋白

12、表達量比C組有所增加；S1P給藥后，與H/R組比較，能明顯增加p-STAT3蛋白的表達；與S1P組相比， stattic處理能顯著抑制p-STAT3蛋白的表達。
　　9. Western Blot法測定胞漿和線粒體的細胞色素C含量
　　1) S1P、AG490和stattic對H/R損傷后H9c2細胞胞漿中的細胞色素C含量變化
　　與C組比較，H/R組胞漿細胞色素C水平明顯增加，S1P可明顯降低H/R損傷引起的胞漿細胞

13、色素C增加。AG490或stattic可明顯抑制S1P降低胞漿細胞色素C的作用。
　　2) S1P、AG490和stattic對H/R損傷后H9c2細胞線粒體中的細胞色素C含量變化
　　H/R組處理可使線粒體細胞色素C水平相比C組明顯降低，S1P可顯著抑制H/R損傷引起的線粒體細胞色素C降低。AG490或Stattic均可明顯抑制S1P增加線粒體細胞色素C的作用。
　　結論：
　　1. S1P能夠提高H9c2心肌

14、細胞缺氧/復氧損傷后的細胞存活率，增加細胞培養(yǎng)液中的T-SOD及Mn-SOD活性，減弱細胞培養(yǎng)液的LDH活力，降低細胞內鈣離子熒光強度，減少線粒體膜電位下降和細胞凋亡，降低caspase3活性，并抑制細胞色素C從線粒體釋放，從而發(fā)揮保護作用。
　　2.本實驗證明，S1P能夠顯著增加 H9c2細胞缺氧/復氧損傷后的 p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達,給予JAK/STAT信號通路的抑制劑AG490或stattic后，S1P的保護