1-磷酸鞘氨醇后適應(yīng)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　 研究1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)后適應(yīng)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.H9c2細(xì)胞的培養(yǎng)及缺氧復(fù)氧損傷模型的建立
　　 大鼠H9c2細(xì)胞株，按常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法接種于含體積分?jǐn)?shù)為10％南美胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、CO2濃度為5％飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。2-3 d換液并傳代一

2、次。
　　 將大鼠H9c2細(xì)胞用模擬缺氧液置換正常培養(yǎng)液，預(yù)先經(jīng)95％ N2+5％ CO2的混合氣飽和10 min，然后放入通有95％ N2+5％ CO2的37℃培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)16h;復(fù)氧時(shí)將缺氧后的心肌細(xì)胞換用預(yù)先用95％空氣+5％ CO2飽和的含藥DMEM低糖培養(yǎng)基，在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4h，建立缺氧/復(fù)氧損傷模型。
　　 2.S1P后適應(yīng)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用
　　 將培養(yǎng)的大鼠H9c2細(xì)胞隨

3、機(jī)分為5組，即(1)正常組;(2)缺氧/復(fù)氧(H/R)組;(3) S1P低濃度(L)組;(4) S1P中濃度(M)組;(5) S1P高濃度(H)組。開始缺氧時(shí)正常組換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);(H/R)組缺氧培養(yǎng)16h，復(fù)氧4h;其余各組則在復(fù)氧前加入相應(yīng)濃度的藥物復(fù)氧4h，終濃度分別為2 mM，4mM,6mM。
　　 3.S1P后適應(yīng)對(duì)大鼠H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用機(jī)制的研究
　　 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;MT

4、T法檢測(cè)細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定細(xì)胞凋亡率;比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中總超氧化物歧化酶(Total SuperOxide Dismutase，T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(Copper/Zinc Super OxideDismutase，CuZn-SOD)和錳超氧化物歧化酶(Manganese Super Oxide Dismutase，Mn-SOD)活力以及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量;熒光顯微鏡下觀察鈣

5、離子濃度;Western Blot測(cè)定H9c2細(xì)胞HSP70蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.H9c2細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，折光率較好，進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、破裂，與正常組相比，缺氧復(fù)氧損傷組細(xì)胞在缺氧16h復(fù)氧4h后存活率顯著降低，且降低程度適中、穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用此模型。
　　 2.H9c2細(xì)胞存活率:與正常組相比，H/R組細(xì)胞的存活率明顯降低(68.72％±6.02％ vs

6、100％±0％, P＜0.01);S1P低、中、高各個(gè)濃度干預(yù)組存活率比H/R組有明顯升高，損傷明顯減輕（73.90％±10.77％ vs68.72％±6.02％,80.15％±9.78％ vs68.72％±6.02％,80.85％±9.50％ vs68.72％±6.02％, P＜0.01, P＜0.01,P＜0.01）。
　　 3.細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量:與正常組比較，H/R組的MDA含量明顯升高（2.55 nmol/L±0.

7、132 nmol/L vs1.37 nmol/L±0.097 nmol/L, P＜0.01）;與H/R組相比，S1P低、中、高各個(gè)濃度組均顯著降低MDA含量（1.98 nmol/L±0.125nmol/L vs2.55 nmol/L±0.132 nmol/L,1.71 nmol/L±0.095 nmol/L vs2.55 nmol/L±0.132 nmol/L,1.67±0.193 nmol/L vs2.55±0.132 nmol/L,

8、 P＜0.01, P＜0.01,P＜0.01）。
　　 4.細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD活力:與正常組比較，H/R組的T-SOD活力明顯降低（11.18 U/ml±1.15 U/ml vs21.14 U/ml±1.33 U/ml, P＜0.01）;與H/R組相比，S1P低、中、高各個(gè)濃度組均顯著升高T-SOD活力（14.00 U/ml±0.89 U/mlvs11.18 U/ml±1.15 U/ml,17.77 U/ml±1.60 U/

9、ml vs11.18 U/ml±1.15 U/ml,18.45 U/ml±1.52 U/mlvs11.18 U/ml±1.15 U/ml, P＜0.05, P＜0.01, P＜0.01)。
　　 細(xì)胞培養(yǎng)液中CuZn-SOD活力:與正常組比較，H/R組的CuZn-SOD活力明顯降低（5.61 U/ml±0.25 U/ml vs11.87 U/ml±0.61 U/ml, P＜0.01）;與H/R組相比，S1P低、中、高各個(gè)濃度組均

10、顯著升高CuZn-SOD活力（7.06 U/ml±0.70U/ml vs5.61 U/ml±0.25 U/ml,8.66 U/ml±0.04 U/ml vs5.61 U/ml±0.25 U/ml,8.98 U/ml±0.42 U/ml vs5.61 U/ml±0.25 U/ml, P＜0.05, P＜0.01, P＜0.01）。
　　 細(xì)胞培養(yǎng)液中Mn-SOD活力:與正常組比較，H/R組的Mn-SOD活力明顯降低（5.56 U/

11、ml±1.12 U/ml vs9.27 U/ml±1.07 U/ml, P＜0.01）;與H/R組相比，S1P低、中、高各個(gè)濃度組均顯著升高M(jìn)n-SOD活力（6.95 U/ml±0.98 U/ml vs5.56 U/ml±1.12 U/ml,9.11 U/ml±1.58 U/ml vs5.56 U/ml±1.12 U/ml,9.46 U/ml±1.59 U/ml vs5.56 U/ml±1.12 U/ml, P＜0.01, P＜0.01

12、, P＜0.01)。
　　 5.細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度的測(cè)定:正常組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度維持在62.04±1.61水平;當(dāng)缺氧復(fù)氧損傷后，H/R組細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增高，與正常組比較具有顯著性差異（82.65±2.21 vs62.04±1.61, P＜0.01）。加入S1P干預(yù)后，S1P低、中、高各個(gè)濃度組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度均有所降低（77.76±0.45 vs82.65±2.21,72.97±0.97 vs82.65±2.21,69.9

13、6±2.02 vs82.65±2.21, P＜0.01, P＜0.01, P＜0.01）。
　　 6.流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定細(xì)胞凋亡率:正常組的H9c2細(xì)胞發(fā)生凋亡較少，H/R組細(xì)胞凋亡比較正常組有顯著增加（20.2％±9.37％ vs5.6％±3.27％，P＜0.01）;經(jīng)過(guò)S1P低、中、高各個(gè)濃度組較H/R組的凋亡率有所下降（13.7％±11.78％ vs20.2％±9.37％，10.5％±8.66％ vs20.2％±9.37％

14、，10.1％±7.39％ vs20.2％±9.37％，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，表明不同濃度的S1P均能有效抑制缺氧復(fù)氧損傷所造成的H9c2細(xì)胞凋亡。
　　 7.HSP70蛋白的表達(dá):與正常組比較，H/R組的HSP70蛋白表達(dá)明顯增多;與H/R組比較，S1P各濃度組的HSP70蛋白表達(dá)明顯增加。
　　 結(jié)論:
　　 1.缺氧復(fù)氧損傷對(duì)H9c2細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，并且呈現(xiàn)一定濃度和時(shí)間依賴