鞘氨醇磷酸膽堿誘導(dǎo)Sca-1+心臟干細(xì)胞向心肌分化的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　急性心肌梗死等缺血性心臟病是世界范圍內(nèi)致死率最高的疾病之一。發(fā)病時(shí)，冠狀動(dòng)脈循環(huán)障礙引發(fā)心臟的局部缺血，導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量急劇減少，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使心功能失調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭。所以，增加心肌細(xì)胞數(shù)量是治療缺血性心臟病的關(guān)鍵。干細(xì)胞移植是心肌再生治療的有效途徑。過去的研究致力于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，但是由于移植率和分化能力極低，治療效果不理想，并且還存在著倫理性問題和免疫排斥問題。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)

2、在心臟內(nèi)存在著一類專能干細(xì)胞，打破了長久認(rèn)為的“心臟是靜止的終末端分化器官”的觀念。這類干細(xì)胞具有進(jìn)行分裂和分化的潛能，被稱作心臟干細(xì)胞(CSCs)。
　　CSCs會(huì)在細(xì)胞表面表達(dá)不同的干細(xì)胞抗原，如:c-kit，sca-1和MDR1等。根據(jù)細(xì)胞表面抗原的種類以及細(xì)胞特性，CSCs可以分為多種類型:sca-1+ CSCs，c-kit+ CSCs，SP細(xì)胞以及Isl1+ CSCs和心臟外植體組織塊形成的干細(xì)胞簇(CDCs)。這些干細(xì)

3、胞都可以分化為心臟譜系的三種細(xì)胞:心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞。但是由于SP細(xì)胞生長周期長，不利于體外研究;c-kit+細(xì)胞提取分離后培養(yǎng)困難;Isl1+細(xì)胞只存在于胚胎期或出生后的年幼心臟中，獲取材料不易以及CDCs所包含的干細(xì)胞種類不純一等特點(diǎn)，都不太適合用于體外分化研究。而sca-1+ CSCs在心臟中含量較高，容易通過磁珠分選的技術(shù)提取，后期培養(yǎng)也比較容易，并且sca-1基因在心臟保護(hù)中起重要作用。因此本研究選取sca

4、-1+ CSCs作為研究材料。
　　鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)是血清中的一種具有生物活性的鞘磷脂。它來源于脂類代謝，是高密度脂蛋白(HDL)的組成成分。作為內(nèi)源性脂類物質(zhì)，SPC對細(xì)胞的毒性更低;更容易穿透細(xì)胞膜發(fā)揮作用。目前對SPC的研究主要集中在腫瘤細(xì)胞的增殖遷移及血管平滑肌細(xì)胞的異常收縮。本實(shí)驗(yàn)室對SPC在心血管細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)SPC可以通過自噬保護(hù)血管內(nèi)皮和心肌細(xì)胞的凋亡。目前對SPC在細(xì)胞分化中的作用研究較

5、少。已有研究表明SPC通過激活Rho激酶促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞的分化，但是對于CSCs向心肌細(xì)胞分化的作用尚未可知。
　　針對以上問題，本論文研究了SPC誘導(dǎo)sca-1+ CSCs向心肌細(xì)胞分化的作用及其分子機(jī)制。我們的研究為誘導(dǎo)心臟干細(xì)胞分化提供了一個(gè)低毒易吸收的工具，相關(guān)分子機(jī)制的研究為治療缺血性心臟疾病提供了新的治療靶點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.成功提取成年小鼠的內(nèi)源性sca-1+心臟干細(xì)胞
　　我

6、們首先運(yùn)用磁珠分選技術(shù)提取了成年小鼠的sca-1+ CSCs。利用流式細(xì)胞術(shù)對培養(yǎng)第1代和第5代的細(xì)胞進(jìn)行純度分析，發(fā)現(xiàn)sca-1的純度達(dá)到90％左右。用倒置顯微鏡觀察SPC處理的sca-1+ CSCs發(fā)現(xiàn)SPC處理2-3周使細(xì)胞拉長。
　　2.SPC促進(jìn)小鼠內(nèi)源性sca-1+心臟干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞
　　我們用1-5μM的SPC處理CSC細(xì)胞2-6周。運(yùn)用qPCR檢測心臟轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和心肌標(biāo)志蛋白在SPC處理后的C

7、SCs中mRNA水平的變化。結(jié)果表明5μM SPC處理2-3周可以促進(jìn)上述因子的轉(zhuǎn)錄。免疫熒光技術(shù)同樣可以檢測出5μM SPC處理3周促進(jìn)心肌分化標(biāo)志物cTnt的表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄因子GATA4的核位移。因此，SPC能誘導(dǎo)CSC向心肌細(xì)胞分化。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SPC能夠降低CSCs的增殖率但并不影響成熟的心肌細(xì)胞的增殖，因此，上述指標(biāo)的上調(diào)并非由于增殖引起。
　　3.JNK信號(hào)參與SPC誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分化過程中
　　由于JNK參

8、與了心肌分化過程，而且JNK在SPC保護(hù)的心肌細(xì)胞凋亡中起重要作用，所以我們檢測了JNK信號(hào)是否參與SPC誘導(dǎo)的分化。Western結(jié)果表明SPC可以在1周，2周時(shí)上調(diào)JNK的磷酸化。qPCR以及免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JNK抑制劑可以逆轉(zhuǎn)SPC誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞marker的上調(diào)。表明JNK參與了SPC誘導(dǎo)的CSCs向心肌細(xì)胞分化過程。
　　4.SPC通過JNK/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)sca-1+心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化
　　有

9、研究報(bào)道STAT3可能參與JNK調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。我們的western實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPC處理1到2周可以上調(diào)STAT3727位點(diǎn)的絲氨酸和705位點(diǎn)的酪氨酸的磷酸化，并且促進(jìn)了STAT3的入核。STAT3的抑制劑Stattic，可以逆轉(zhuǎn)SPC誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞marker的mRNA和蛋白水平的上調(diào)。所以SPC可以通過STAT3來調(diào)節(jié)分化。我們進(jìn)一步驗(yàn)證了JNK和STAT3之間的上下游關(guān)系，發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑SP600125可以抑制STAT3的

10、磷酸化，但是STAT3的抑制劑stattic并不能影響JNK的磷酸化，說明STAT3是JNK的一個(gè)下游靶點(diǎn)。因此，SPC可以通過調(diào)節(jié)JNK/STAT3信號(hào)通路來誘導(dǎo)心肌分化。
　　5.SPC通過GSK3β調(diào)節(jié)β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)Sca-1+心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路是分化過程中的經(jīng)典通路。我們western檢測GSK3β和β-catenin的變化，發(fā)現(xiàn)SPC處理1小時(shí)會(huì)促進(jìn)G

11、SK3β磷酸化短暫升高，在1周和2周時(shí)引起磷酸化降低，GSK3β的增加，該過程伴隨β-catenin磷酸化升高，及總量降低。GSK3β的抑制劑LiCl和SB216763均能逆轉(zhuǎn)SPC誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分化，并且調(diào)控β-catenin。β-catenin的抑制劑XAV939會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)SPC誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞marker的表達(dá)。因此，SPC可以通過調(diào)節(jié)GSK3β/β-catenin信號(hào)通路來誘導(dǎo)心肌分化。
　　6.JNK/STAT3信號(hào)通路

12、與β-catenin信號(hào)通路之間無交叉
　　為了研究JNK/STAT3信號(hào)通路與β-catenin信號(hào)通路之間是否有交叉，我們利用一系列的抑制劑，western檢測發(fā)現(xiàn)SP600125和stattic并不能影響GSK3β和β-catenin，而且GSK3β的抑制劑也不會(huì)影響JNK/STAT3。表明這兩條通路是獨(dú)立的。
　　7.脂筏有可能作為一個(gè)激活JNK/STAT3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)子存在
　　脂筏是細(xì)胞膜上富含膽固醇的微