鞘氨醇磷酸膽堿誘導Sca-1+心臟干細胞向心肌分化的分子機制研究.pdf

1、背景及目的：
　　急性心肌梗死等缺血性心臟病是世界范圍內致死率最高的疾病之一。發(fā)病時，冠狀動脈循環(huán)障礙引發(fā)心臟的局部缺血，導致心肌細胞數(shù)量急劇減少，嚴重時會使心功能失調進而導致心力衰竭。所以，增加心肌細胞數(shù)量是治療缺血性心臟病的關鍵。干細胞移植是心肌再生治療的有效途徑。過去的研究致力于誘導胚胎干細胞或間充質干細胞向心肌細胞的分化，但是由于移植率和分化能力極低，治療效果不理想，并且還存在著倫理性問題和免疫排斥問題。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)

2、在心臟內存在著一類專能干細胞，打破了長久認為的“心臟是靜止的終末端分化器官”的觀念。這類干細胞具有進行分裂和分化的潛能，被稱作心臟干細胞(CSCs)。
　　CSCs會在細胞表面表達不同的干細胞抗原，如:c-kit，sca-1和MDR1等。根據(jù)細胞表面抗原的種類以及細胞特性，CSCs可以分為多種類型:sca-1+ CSCs，c-kit+ CSCs，SP細胞以及Isl1+ CSCs和心臟外植體組織塊形成的干細胞簇(CDCs)。這些干細

3、胞都可以分化為心臟譜系的三種細胞:心肌細胞，血管內皮細胞和血管平滑肌細胞。但是由于SP細胞生長周期長，不利于體外研究;c-kit+細胞提取分離后培養(yǎng)困難;Isl1+細胞只存在于胚胎期或出生后的年幼心臟中，獲取材料不易以及CDCs所包含的干細胞種類不純一等特點，都不太適合用于體外分化研究。而sca-1+ CSCs在心臟中含量較高，容易通過磁珠分選的技術提取，后期培養(yǎng)也比較容易，并且sca-1基因在心臟保護中起重要作用。因此本研究選取sca

4、-1+ CSCs作為研究材料。
　　鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)是血清中的一種具有生物活性的鞘磷脂。它來源于脂類代謝，是高密度脂蛋白(HDL)的組成成分。作為內源性脂類物質，SPC對細胞的毒性更低;更容易穿透細胞膜發(fā)揮作用。目前對SPC的研究主要集中在腫瘤細胞的增殖遷移及血管平滑肌細胞的異常收縮。本實驗室對SPC在心血管細胞凋亡中的作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)SPC可以通過自噬保護血管內皮和心肌細胞的凋亡。目前對SPC在細胞分化中的作用研究較

5、少。已有研究表明SPC通過激活Rho激酶促進間充質干細胞向血管平滑肌細胞的分化，但是對于CSCs向心肌細胞分化的作用尚未可知。
　　針對以上問題，本論文研究了SPC誘導sca-1+ CSCs向心肌細胞分化的作用及其分子機制。我們的研究為誘導心臟干細胞分化提供了一個低毒易吸收的工具，相關分子機制的研究為治療缺血性心臟疾病提供了新的治療靶點。
　　結果：
　　1.成功提取成年小鼠的內源性sca-1+心臟干細胞
　　我

6、們首先運用磁珠分選技術提取了成年小鼠的sca-1+ CSCs。利用流式細胞術對培養(yǎng)第1代和第5代的細胞進行純度分析，發(fā)現(xiàn)sca-1的純度達到90％左右。用倒置顯微鏡觀察SPC處理的sca-1+ CSCs發(fā)現(xiàn)SPC處理2-3周使細胞拉長。
　　2.SPC促進小鼠內源性sca-1+心臟干細胞分化為心肌細胞
　　我們用1-5μM的SPC處理CSC細胞2-6周。運用qPCR檢測心臟轉錄因子，轉錄增強子和心肌標志蛋白在SPC處理后的C

7、SCs中mRNA水平的變化。結果表明5μM SPC處理2-3周可以促進上述因子的轉錄。免疫熒光技術同樣可以檢測出5μM SPC處理3周促進心肌分化標志物cTnt的表達以及轉錄因子GATA4的核位移。因此，SPC能誘導CSC向心肌細胞分化。EdU實驗結果表明SPC能夠降低CSCs的增殖率但并不影響成熟的心肌細胞的增殖，因此，上述指標的上調并非由于增殖引起。
　　3.JNK信號參與SPC誘導的心肌細胞分化過程中
　　由于JNK參

8、與了心肌分化過程，而且JNK在SPC保護的心肌細胞凋亡中起重要作用，所以我們檢測了JNK信號是否參與SPC誘導的分化。Western結果表明SPC可以在1周，2周時上調JNK的磷酸化。qPCR以及免疫熒光實驗結果表明，JNK抑制劑可以逆轉SPC誘導的心肌細胞marker的上調。表明JNK參與了SPC誘導的CSCs向心肌細胞分化過程。
　　4.SPC通過JNK/STAT3信號通路誘導sca-1+心臟干細胞向心肌細胞分化
　　有

9、研究報道STAT3可能參與JNK調節(jié)的信號通路。我們的western實驗結果表明，SPC處理1到2周可以上調STAT3727位點的絲氨酸和705位點的酪氨酸的磷酸化，并且促進了STAT3的入核。STAT3的抑制劑Stattic，可以逆轉SPC誘導的心肌細胞marker的mRNA和蛋白水平的上調。所以SPC可以通過STAT3來調節(jié)分化。我們進一步驗證了JNK和STAT3之間的上下游關系，發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑SP600125可以抑制STAT3的

10、磷酸化，但是STAT3的抑制劑stattic并不能影響JNK的磷酸化，說明STAT3是JNK的一個下游靶點。因此，SPC可以通過調節(jié)JNK/STAT3信號通路來誘導心肌分化。
　　5.SPC通過GSK3β調節(jié)β-catenin信號通路誘導Sca-1+心臟干細胞向心肌細胞的分化
　　Wnt/β-catenin信號通路是分化過程中的經(jīng)典通路。我們western檢測GSK3β和β-catenin的變化，發(fā)現(xiàn)SPC處理1小時會促進G

11、SK3β磷酸化短暫升高，在1周和2周時引起磷酸化降低，GSK3β的增加，該過程伴隨β-catenin磷酸化升高，及總量降低。GSK3β的抑制劑LiCl和SB216763均能逆轉SPC誘導的心肌細胞分化，并且調控β-catenin。β-catenin的抑制劑XAV939會進一步促進SPC誘導的心肌細胞marker的表達。因此，SPC可以通過調節(jié)GSK3β/β-catenin信號通路來誘導心肌分化。
　　6.JNK/STAT3信號通路

12、與β-catenin信號通路之間無交叉
　　為了研究JNK/STAT3信號通路與β-catenin信號通路之間是否有交叉，我們利用一系列的抑制劑，western檢測發(fā)現(xiàn)SP600125和stattic并不能影響GSK3β和β-catenin，而且GSK3β的抑制劑也不會影響JNK/STAT3。表明這兩條通路是獨立的。
　　7.脂筏有可能作為一個激活JNK/STAT3信號通路的調節(jié)子存在
　　脂筏是細胞膜上富含膽固醇的微