ApoA-I介導(dǎo)內(nèi)皮細胞1-磷酸鞘氨醇釋放及其信號機制研究.pdf

1、背景與目的：1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate,S1P)是由鞘氨醇激酶1/2(sphingosine kinase1/2，SphK1/2)磷酸化鞘氨醇而合成。血管內(nèi)皮細胞，紅細胞和血小板等是血液S1P的主要來源。脂蛋白是S1P在血漿中的主要結(jié)合載體，而絕大多數(shù)與高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)結(jié)合。HDL結(jié)合的S1P(HDL-S1P)也賦予HDL很多生物學(xué)功能，如抗血栓

2、，保護內(nèi)皮功能和抗動脈粥樣硬化等作用。而 S1P釋放到細胞外通常受到細胞內(nèi)或細胞外的刺激。載脂蛋白 A-I(apolipoproteinA-I, apoA-I)與ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette A1, ABCA1)的結(jié)合是HDL生成的起始過程，也是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的限速步驟。ApoA-I也能結(jié)合清道夫受體B類I型(scavenger receptor class B type I，SR-BI)進行膽固醇和

3、磷脂的雙向轉(zhuǎn)運。ApoA-I除轉(zhuǎn)運膽固醇外，還可轉(zhuǎn)運其他磷脂成分。S1P即是一種信號鞘磷脂，賦予HDL諸多重要作用。作為HDL的主要載脂蛋白，apoA-I是否能促進血管內(nèi)皮細胞S1P釋放，及其受體信號機制如何是本實驗的研究目的。
　　方法：以 apoA-I不同時間和不同濃度處理培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)。轉(zhuǎn)染SphK，ABCA1和SR-B1 s

4、iRNA48小時后，20μg/ml apoA-I孵育5分鐘。HUVECs分別預(yù)孵育N,N-Dimethylsphingosine(SphK1抑制劑)、U0126(ERK1/2抑制劑)、glybenclamide(ABCA1抑制劑)、BLT-1(SR-BI抑制劑)、AG490(JAK2抑制劑)、PP2(Src抑制劑)或PTX(G蛋白抑制劑)后，20μg/ml apoA-I或1μM S1P孵育5分鐘。HUVECs預(yù)孵育glybenclami

5、de后，20μg/ml apoA-I處理10分鐘，5分鐘時額外處理SEW2871(S1PR1激動劑)五分鐘。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定細胞內(nèi)及培養(yǎng)基S1P濃度。免
　　疫印跡方法(Western blot，WB)檢測ERK1/2磷酸化水平。
　　結(jié)果：ApoA-I促進內(nèi)皮細胞S1P釋放，在5分鐘至10分鐘之間達到峰值之后緩慢下降。apoA-I能

6、增加細胞內(nèi)S1P水平，1至3分鐘明顯升高，而后下降。SphK1的抑制劑或siRNA均減少apoA-I誘導(dǎo)的S1P釋放。apoA-I能激活內(nèi)皮細胞ERK1/2磷酸化，且ERK1/2抑制劑減少apoA-I誘導(dǎo)的S1P釋放。ABCA1和SR-BI抑制劑或siRNA均能減少apoA-I誘導(dǎo)的S1P釋放和ERK1/2磷酸化水平。但是，JAK2或Src抑制并不能減少apoA-I誘導(dǎo)的S1P釋放和ERK1/2磷酸化水平。ABCA1，SR-BI抑制并不

7、能減少S1P誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化，而S1PR1/3抑制劑能減少S1P誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化。在ABCA1被抑制后，S1PR1激動劑能增加細胞內(nèi)S1P水平，但不能明顯增加apoA-I誘導(dǎo)的S1P釋放。
　　結(jié)論:
　　1.ApoA-I能促進內(nèi)皮細胞S1P釋放增加。
　　2.ApoA-I通過內(nèi)皮細胞釋放的S1P，激活S1PR1/3-ERK1/2-SphK1途徑間接增加細胞內(nèi)S1P水平。
　　3.ApoA-I介導(dǎo)