1-磷酸鞘氨醇抑制環(huán)磷酰胺致胎兒卵巢卵泡凋亡的研究.pdf

1、目的：隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，放化療大量應(yīng)用于癌癥患者的治療，使癌癥患者的生存率大大提高。隨著放化療所帶來(lái)的卵巢早衰，大大降低了癌癥生存患者的生活質(zhì)量。最近研究證實(shí)凋亡是化療導(dǎo)致卵巢早衰的一個(gè)重要的機(jī)制之一。國(guó)內(nèi)外大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)1-磷酸鞘氨醇可以抑制放化療導(dǎo)致鋸齒類動(dòng)物鼠的卵巢卵泡凋亡，但是1-磷酸鞘氨醇是否同樣可以抑制放化療對(duì)人的卵巢的破壞作用則研究較少，故本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立異種移植模型，將胎兒卵巢組織異種移植到裸鼠體內(nèi)，研究1-磷

2、酸鞘氨醇是否可以通過(guò)抑制化療藥物環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的胎兒卵巢卵泡的凋亡，發(fā)揮保護(hù)卵巢功能的作用。
　　 方法：收集引產(chǎn)胎兒卵巢標(biāo)本，采用程序化冷凍和快速融解法處理，凍融前后胎兒卵巢組織片經(jīng)光電鏡分析，取足夠新鮮的凍融胎兒卵巢標(biāo)本進(jìn)行異種移植至裸鼠背部?jī)蓚?cè)皮下自制的小囊內(nèi)，將1-磷酸鞘氨醇(S1P)粉劑溶于由5％的聚乙二醇，2.5％的乙醇，0.8％的吐溫-80組成的PET介質(zhì)中，濃度為2.0mM，取部分2.0mM的s1p進(jìn)一步稀釋至0.

3、5mM濃度;利用微量加樣器將不同濃度的1-磷酸鞘氨醇（A左0.5mM組，A右2.0mM組）、PET（B組）和生理鹽水（C組）和生理鹽水(D組，移植對(duì)照組)注入兩側(cè)小囊內(nèi)。移植1小時(shí)后，A、B、C三組經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺(1mg/ml200mg/kg)，D組未經(jīng)環(huán)磷酰胺處理作為移植對(duì)照組。移植2周后回收各組移植物，行石蠟包埋HE染色光鏡分析、戊二醛固定電鏡分析超微結(jié)構(gòu)和免疫組化TUNAL檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 一

4、.凍融前后胎兒卵巢光鏡下形態(tài)學(xué)及電鏡下超微結(jié)構(gòu)的比較
　　 (1)光鏡下觀察，新鮮和凍融組胎兒卵巢組織絕大部分均為原始卵泡，且原始卵泡結(jié)構(gòu)絕大部分均保存較好，為正常原始卵泡結(jié)構(gòu)。與新鮮組相比，凍融組原始卵泡密度稍有降低，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(25±14.82 vs24.81±14.36，P＞0.05)。
　　 (2)電鏡下觀察凍融前后的卵巢的超微結(jié)構(gòu)，新鮮組和凍融組中絕大部分卵泡均保存較完整的結(jié)構(gòu)，較新鮮組，凍融組中卵母細(xì)胞中胞

5、漿內(nèi)空泡增多。少部分線粒體體積增大，呈輕度腫脹，嵴偶有消失，僅見(jiàn)個(gè)別卵母細(xì)胞出現(xiàn)核膜輕度皺縮。
　　 二.凍融組（移植前）胎兒卵巢組織與D組（移植對(duì)照組）的比較
　　 (1)HE染色光鏡下觀察見(jiàn)D組（移植對(duì)照組）原始卵泡明顯下降，與凍融組（移植前）相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(15.23±6.28 vs24.81±14.36，p＜0.05)。凍融組（移植前）胎兒卵巢組織絕大部分均為形態(tài)正常的原始卵泡結(jié)構(gòu)。D組（移植對(duì)照組）存活的原

6、始卵泡結(jié)構(gòu)正常，部分卵泡出現(xiàn)卵母細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿深染，核膜皺縮。
　　 (2)電鏡下觀察凍融組（移植前）中絕大部分卵泡包膜胞漿核均保存較完整的結(jié)構(gòu)，而D組（移植對(duì)照組）中部分卵泡出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，卵母細(xì)胞胞膜尚完整，胞漿內(nèi)偶有空泡形成，線粒體呈輕度腫脹，嵴仍可見(jiàn)，核膜完整，核周隙無(wú)擴(kuò)張，核內(nèi)染色體呈顆粒狀均勻分布。顆粒細(xì)胞較完整，與卵母細(xì)胞連接較緊密，胞漿內(nèi)有空泡形成，線粒體輕度腫脹，核膜完整，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。
　　

7、 三.異種移植各組胎兒卵巢組織的比較
　　 1.D組（移植對(duì)照組）與C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）的比較
　　 (1)光鏡下觀察D組（移植對(duì)照組），存活的原始卵泡結(jié)構(gòu)保存良好，而C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）卵泡損傷較大，絕大部分原始卵泡結(jié)構(gòu)異常，出現(xiàn)卵母細(xì)胞不規(guī)則，胞漿嗜酸性增強(qiáng)，部分細(xì)胞核皺縮，核深染，染色質(zhì)聚集。卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞不完整，甚至缺如，顆粒細(xì)胞排列紊亂，胞漿深染，核固縮，染色質(zhì)聚集。基底膜不完整。卵巢間

8、質(zhì)水腫較明顯，間質(zhì)細(xì)胞較少，間質(zhì)出現(xiàn)明顯纖維化。與D組（移植對(duì)照組）相比，C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）原始卵泡密度明顯下降(15.23±6.28 vs8.62±5.00，P＜0.05)。
　　 (2)電鏡下觀察D組（移植對(duì)照組）中存活的卵母細(xì)胞胞膜尚完整，胞漿內(nèi)偶有空泡形成，線粒體呈輕度腫脹，嵴仍可見(jiàn)。而C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）大部分卵泡結(jié)構(gòu)均已被破壞，只有部分卵泡尚完整。卵母細(xì)胞胞膜不完整，胞漿內(nèi)空泡增多，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)消失，

9、線粒體腫脹明顯，空泡化，甚至斷裂，核膜皺縮，核染色質(zhì)深染，聚集。顆粒細(xì)胞不完整，甚至缺如。顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間微絨毛結(jié)構(gòu)消失，顆粒細(xì)胞包膜不完整，胞漿空泡化，甚至核膜消失，核染色質(zhì)深染聚集。
　　 (3)TUNEL檢測(cè)，凋亡卵泡數(shù)/所有卵泡數(shù)為凋亡卵泡百分率。與D組（移植對(duì)照組）相比，C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）中凋亡卵泡百分率明顯增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(15％±3％ vs71％±4％，P＜0.05)。
　　 2.環(huán)磷酰

10、胺處理各組的比較
　　 (1)光鏡下觀察B組(PET+環(huán)磷酰胺組)，C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組），A左組(0.5mM s1p)中，絕大部分原始卵泡結(jié)構(gòu)異常。包膜，胞漿及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)異常，而A右組(2.0mM s1p)中則大部分原始卵泡結(jié)構(gòu)正常，部分卵泡出現(xiàn)卵母細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿深染。與C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）相比，B組(PET+環(huán)磷酰胺組)及A左組(0.5mM s1p)中原始卵泡密度均無(wú)明顯差異(8.62±5.00 v

11、s9.31±6.91 vs9.82±5.24， P＞0.05)。而A右組(2.0mM s1p)則明顯較高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(8.62±5.00 vs13.25±6.61，P＜0.05)。與A左組(0.5mM s1p)相比，A右組(2.0mM s1p)中原始卵泡密度明顯較高(9.82±5.24 vs13.25±6.61， P＜0.05)。
　　 (2)電鏡下觀察B組（PET+環(huán)磷酰胺組），C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組），A左組(0.

12、5mM s1p)絕大部分卵泡結(jié)構(gòu)均已破壞，而A右組（2.0mM s1p）卵泡結(jié)構(gòu)保存相對(duì)較好，部分卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)水腫明顯，有空泡形成，線粒體腫脹明顯，嵴消失，核膜尚完整，偶有染色質(zhì)深染聚集。顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞微絨毛交錯(cuò)結(jié)構(gòu)尚完整，線粒體腫脹明顯，嵴消失，偶有斷裂，核膜尚完整，偶有核膜皺縮。
　　 (3)TUNEL檢測(cè)，與C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）相比，B組（PET+環(huán)磷酰胺組）中凋亡原始卵泡百分率無(wú)明顯變化(71％±4％ vs

13、68％±3％，P＞0.05)，而A左組(0.5mM s1p)中凋亡原始卵泡百分率則降低，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(71％±4％ vs62％±2％，P＞0.05)。在A右組(2.0mM s1p)中則下降明顯(71％±4％ vs18％±2％，P＜0.05)。與A左組(0.5mM s1p)相比，A右組(2.0mM s1p)中凋亡原始卵泡百分率降低明顯，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(62％±2％ vs18％±2％，p＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　

14、 1.凍融組中胎兒卵巢中原始卵泡密度比較新鮮組無(wú)明顯下降，且電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)的改變較輕微，結(jié)合光電鏡評(píng)估常規(guī)慢凍速融方法對(duì)人胎兒卵巢卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好。充分表明凍融胎兒卵巢可代替新鮮胎兒卵巢，有利于實(shí)驗(yàn)的可操作性。
　　 2.移植過(guò)程的缺血缺氧導(dǎo)致胎兒卵巢卵泡大量的丟失，僅有部分卵泡能存活。
　　 3.化療藥物環(huán)磷酰胺對(duì)卵巢卵泡有明顯的毒性作用，表現(xiàn)為加速胎兒卵巢原始卵泡的凋亡。
　　 4.1-磷酸鞘氨醇