1-磷酸鞘氨醇受體表達(dá)失衡參與心梗后心室重塑的研究.pdf

1、1研究背景：
　　心室重塑是急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后發(fā)生慢性心力衰竭（heart failure，HF）的中心環(huán)節(jié)。心室重塑不僅歸因于心肌細(xì)胞的凋亡、肥大，纖維組織的形成也發(fā)揮了重要作用，目前調(diào)控纖維化發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制仍未完全揭示。
　　較多文獻(xiàn)報(bào)道1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）與心肌缺血/再灌注、冠心病、AMI之間有密切關(guān)

2、系。目前在心臟組織發(fā)現(xiàn)有 S1P1、S1P2、S1P33種S1P受體表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)：在缺氧條件下S1P對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)S1P對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過(guò)S1P1作用實(shí)現(xiàn)；近期有文獻(xiàn)報(bào)道S1P1信號(hào)通路在調(diào)節(jié)AMI后心肌炎癥反應(yīng)過(guò)程起重要作用；另外，通過(guò)體內(nèi)、體外研究證實(shí)：S1P2、S1P3信號(hào)參與了心臟纖維化的進(jìn)程。
　　基于文獻(xiàn)分析我們發(fā)現(xiàn)：S1P通過(guò)受體產(chǎn)生促進(jìn)心肌細(xì)胞存活和加劇心肌纖維化的雙重作用。我們

3、推斷：在正常心肌組織中 S1P受體的表達(dá)處于一種平衡狀態(tài)，這種狀態(tài)參與維持心臟的正常組織形態(tài)及功能。那么，AMI后心室重塑的進(jìn)程中是否存在 S1P1、S1P2、S1P3表達(dá)失衡？它們?cè)谛呐K非梗死區(qū)、梗死區(qū)的表達(dá)變化趨勢(shì)是否一致？通過(guò)調(diào)節(jié) S1P受體是否能夠抑制心室重塑的發(fā)生、發(fā)展？上述問(wèn)題報(bào)道較少且存在爭(zhēng)議，特別是梗死區(qū)上述3種受體的表達(dá)變化尚未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在對(duì)上述3個(gè)問(wèn)題進(jìn)行探討，通過(guò)在體研究干預(yù)S1P及下游信號(hào)，為改善AM

4、I患者預(yù)后提供新的思路。
　　2研究目的：
　?。?）探討 AMI后心室重塑階段非梗死區(qū)、梗死區(qū) S1P1、S1P2、S1P3的表達(dá)變化。
　?。?）通過(guò)干預(yù)S1P受體觀察對(duì)AMI后心室重塑和心功能的影響。
　　3研究方法：
　?。?）實(shí)驗(yàn)一：采用體重在220g～250g雄性SD大鼠，隨機(jī)分為：假手術(shù)組、心梗組，采取開胸結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈的方法建立心梗后心衰模型。術(shù)后8周，通過(guò)HE染色、Masson染色、血清

5、BNP(brain natriuretic peptide)檢測(cè)、記錄心電圖、心功能測(cè)定等手段，對(duì)這種造模方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　（2）實(shí)驗(yàn)二：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、1周梗死組、4周梗死組、8周梗死組，按照實(shí)驗(yàn)一的方法構(gòu)建模型。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）的檢測(cè)方法，對(duì)正常心臟以及心梗后1周、4周、8周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)大

6、鼠心臟組織中S1P1、S1P2、S1P3mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　?。?）實(shí)驗(yàn)三：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、AMI組、Sham+SEW2871組、AMI+SEW2871組。對(duì)Sham+SEW2871組、AMI+SEW2871組，經(jīng)口給予S1P1特異性激動(dòng)劑SEW2871，劑量：7mg/kg/d，直至處死前。術(shù)后8周，通過(guò)心臟超聲測(cè)定心功能，激光多普勒檢測(cè)心臟微循環(huán)灌注，ELISA法檢測(cè)血清心衰標(biāo)志物BNP

7、變化，Masson染色評(píng)估膠原容積分?jǐn)?shù)。
　?。?）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的表示方法，利用GraphPad Prism6.02軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)對(duì)單因素兩組之間進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用方差分析法對(duì)單因素多組間進(jìn)行兩兩比較，當(dāng) P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4研究結(jié)果：
　?。?）實(shí)驗(yàn)一：
　?、俳Y(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈的造模方法能夠保證較高的動(dòng)物存活率，本研究中假手

8、術(shù)組、心梗組大鼠存活率分別為：75.0％、72.5%。
　?、谛墓＝M左冠脈結(jié)扎5分鐘后可記錄到心電圖I、II、aVL導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)J點(diǎn)上移超過(guò)0.1mv，ST段抬高（多為弓背向上型）0.2mv以上，假手術(shù)組無(wú)上述變化。
　?、坌g(shù)后8周心臟超聲檢測(cè)：心梗組左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)：29.20±1.75%，假術(shù)組：33.17±1.32%，心梗組LVFS低于

9、假手術(shù)組(P＜0.01)；心梗組左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）：63.24±1.88%，假手術(shù)組：71.12±0.79%，心梗組 LVEF均低于假手術(shù)組(P＜0.01)。
　?、蹾E染色可見梗死部位心室壁明顯變薄，肌纖維被疏松結(jié)締組織取代，殘存肌細(xì)胞增生，成纖維細(xì)胞增生，血管增生充血明顯。
　　⑤Masson染色顯示心肌梗死區(qū)域殘存心肌之間纖維瘢痕形成，呈交錯(cuò)分

10、布。
　?、扌g(shù)后8周，心梗組與假手術(shù)組血清BNP水平分別為：648.44±9.37ng/mL、541.65±33.34ng/mL，心梗組明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。
　?。?）實(shí)驗(yàn)二：
　?、僭贏MI后1周、4周、8周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別檢測(cè)S1P1的mRNA和蛋白表達(dá)，并與正常對(duì)照心肌組織（ mRNA表達(dá):33.34±6.80，蛋白表達(dá)：295.3±57.22 ng/g）比較，發(fā)現(xiàn)：梗死區(qū)中S1P1的mRNA和蛋白

11、表達(dá)水平在1周組（mRNA表達(dá):28.47±8.01，蛋白表達(dá)：240.7±47.22ng/g）、4周組（mRNA表達(dá):13.70±5.25，蛋白表達(dá)：137.4±17.04 ng/g）均降低（P＜0.05）。
　?、谠贏MI后1周、4周、8周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別檢測(cè)S1P2的mRNA和蛋白表達(dá)，非梗死區(qū)中的S1P2mRNA表達(dá)水平在對(duì)照組（1405±169.60）和心梗不同時(shí)間點(diǎn)之間比較均無(wú)顯著差異。相比之下，梗死區(qū)S1P2mRNA

12、變化趨勢(shì)卻極為顯著，降低趨勢(shì)持續(xù)至術(shù)后4周（163.6±16.45）（P＜0.01）；非梗死區(qū) S1P2蛋白表達(dá)在心梗1周、4周組呈下降趨勢(shì)，4周組(91.21±15.30ng/g)較對(duì)照組(180.9±34.00ng/g)明顯下降（P＜0.01）, S1P2蛋白在梗死區(qū)不同組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　?、墼贏MI后1周、4周、8周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別檢測(cè)S1P3的mRNA和蛋白表達(dá)，非梗死區(qū)的S1P3mRNA表達(dá)在梗死

13、1周（565.7±30.85）較正常對(duì)照組（434.5±15.61）顯著升高（P＜0.05），至術(shù)后8周降低至正常對(duì)照組水平；梗死區(qū)S1P3mRNA表達(dá)在1周組升高（P＜0.01）,變化特點(diǎn)與非梗死區(qū)變化趨勢(shì)相似；S1P3蛋白在梗死區(qū)和非梗死區(qū)表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05）。
　?。?）實(shí)驗(yàn)三：
　　①手術(shù)8周后，檢測(cè)心臟多譜勒超聲顯示：AMI+SEW2871組與AMI組比較， LVFS、LVEF均增高，其中LVFS指標(biāo) AMI

14、+SEW2871組（32.12±0.89%）較AMI組（29.65±1.49%）增高（P＜0.01），LVEF測(cè)量顯示AMI+SEW2871組（66.32±1.60%）也較AMI組（62.32±1.69%）增高（P＜0.01）。
　?、谑中g(shù)8周后，激光多普勒血流儀掃描各組大鼠心臟表面血流量發(fā)現(xiàn)AMI+SEW2871組中的紅色和黃色信號(hào)較AMI組明顯增多，藍(lán)色信號(hào)減少，測(cè)定灌注單位（perfusion units，PU）值：Sham

15、組1015±96.17、AMI組688.9±70.19、 Sham+SEW2871組985.4±46.47、 AMI+SEW2871組823.2±110.80，AMI+SEW2871組PU值較AMI組增高（P＜0.05）。
　　③手術(shù)8周后，血清BNP檢測(cè)，AMI+SEW2871組（638.2±38.99 ng/mL）較AMI組（650.7±34.06 ng/mL）有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　④手術(shù)8周后， Mas

16、son染色經(jīng)圖像分析獲得膠原容積分?jǐn)?shù)（%）， AMI+SEW2871組（梗死區(qū)：34.33±4.43%，非梗死區(qū)：16.83±2.17%），AMI組（梗死區(qū)：40.80±6.92%，非梗死區(qū)：20.61±2.71%），梗死區(qū)和非梗死區(qū)的膠原容積分?jǐn)?shù)顯示，AMI+SEW2871組較AMI組均有降低趨勢(shì)，但在僅梗死區(qū)兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　5研究結(jié)論：
　　（1）首次較完整闡述了S1P1、S1P2、S1P33