1-磷酸鞘氨醇及中性神經(jīng)酰胺酶保護炎癥因子引起的胰島β細胞凋亡.pdf

1、1-磷酸銷氨醇及中性神經(jīng)酰胺酶保護炎癥因子引起的胰島β細胞凋亡 目的： (1)觀察外源性1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是否減少炎癥因子引起的胰島β細胞凋亡。 (2)探討S1P保護胰島β細胞的可能機制。 (3)觀察胰島β細胞是否存在中性神經(jīng)酰胺酶(neutral ceramidase，N-CDase)活性及表達。 (4)觀察炎癥因子刺激是否引起胰島β細胞N-

2、CDase的活性及表達變化。 (5)觀察抑制N-CDase活性是否影響炎癥因子引起的胰島p細胞凋亡。 方法： (1)貼壁法培養(yǎng)大鼠胰島β細胞系INS-1細胞，聯(lián)合應用炎癥因子白介素-1β(IL-1β，5 ng/mL)、腫瘤壞死因子(TNF-a，10 ng/mL)和干擾素一γ(IFN-γ，50 ng/mL)刺激INS-1細胞24 h，流式細胞術檢測細胞凋亡。 (2)1μMS1P預處理INS-1細胞1 h，隨

3、后，應用炎癥因子及S1P與INS-1細胞共培養(yǎng)24 h，流式細胞術檢測細胞凋亡。 (3)western-blot方法檢測凋亡相關蛋白cleaved-caspase-3的表達。 (4)應用有機萃取和高效液相色譜(HPLC)方法定量測定正常培養(yǎng)以及炎癥因子刺激下INS-1細胞的N-CDase的活性。 (5)采用半定量RT-PCR和定量real-time PCR方法測定正常培養(yǎng)以及炎癥因子刺激下INS-1細胞的N-CD

4、ase基因表達，western-blot方法檢測N-CDase蛋白表達。 (6)應用N-CDase抑制劑D-MAPP(終濃度為10μM)抑制INS-1細胞N-CDase活性，HPLC方法測定抑制后酶活性的降低。 (7)應用D-MAPP與炎癥因子共培養(yǎng)INs-1細胞24 h，流式細胞術測定細胞凋亡。 結果： (1)INS-1細胞貼壁生長狀況良好，正常培養(yǎng)條件下凋亡不明顯；而聯(lián)合應用炎癥因子IL-1β、TNF

5、-αIFN-γ刺激24 h后INS-1細胞出現(xiàn)明顯凋亡。 (2)應用1μMS1P預處INS-1細胞并與細胞共培養(yǎng)，能顯著減少炎癥因子引起的細胞凋亡。 (3)應用1μMS1P預處理并與INs-1細胞共培養(yǎng)，能顯著抑制炎癥因子刺激下的細胞cleaved-caspase-3的表達。 (4)正常培養(yǎng)的INS-1細胞存在一定的N-CDause活性，炎癥因子刺激能明顯增加INS-1細胞的N-CDase活性：最早在刺激8 h后

6、即能觀察到N-CDase活性明顯增加，在刺激16 h后達到高峰，并且，這種增加在刺激24 h后仍能被檢測到。 (5)炎癥因子刺激能明顯增加INs-1細胞的N-cDase蛋白表達，并與其活性增加的時間依賴性較一致。 (6)炎癥因子刺激能明顯增加INs-1細胞的N-CDase基因表達，在刺激4h后出現(xiàn)N-CDase基因表達顯著增強，刺激12h后達到高峰。 (7)應用10μMD-MAPP預處理及與INs-1細胞共培養(yǎng)，

7、能明顯降低正常培養(yǎng)和炎癥因子刺激的INS-1細胞的N-CDase活性。 (8)應用10μMD-MAPP預處理及與INS-1細胞共培養(yǎng)，能明顯增加炎癥因子刺激引起的INS-1細胞凋亡。 結論： (1)聯(lián)合應用炎癥因子刺激24 h能引起INS-1細胞凋亡，而外源性S1P能減輕炎癥因子引起的細胞凋亡。 (2)S1P可能通過抑制凋亡相關蛋白cleaved-caspase-3表達，從而減輕炎癥因子引起的INS-1細