油菜根腫孢子（Plasmodiophora brassicae）免疫檢測方法的初步構(gòu)建.pdf

1、根腫菌是世界范圍內(nèi)流傳的一種危害嚴(yán)重的植物致病菌，其感染的宿主不僅十字花科植物如油料作物(油菜)，蔬菜類作物(花椰菜、甘藍(lán)、白菜等)，還能夠感染一些十字花科的野生植物等。休眠孢子在大田存留6-20y仍難殺滅，傳播方式多樣，可導(dǎo)致十字花科蔬菜的大面積減產(chǎn)，危害糧食生產(chǎn)的安全。目前采用的防治方法不論是農(nóng)田熏蒸消毒、化學(xué)殺滅，還是生物學(xué)防治都只是相對抑制或減少孢子數(shù)量，沒有完全殺滅孢子作用，而采用與單子葉植物輪作可使孢子數(shù)量降低到不構(gòu)成危害的

2、程度，是一種有效的防治手段。另外，根腫菌是一種專性寄生菌，其菌體很難進(jìn)行離體培養(yǎng)和人工馴化，這就給研究造成一定的難度。所以尋求一種簡單易行的快速檢測手段，不僅可對現(xiàn)在的十字花科蔬菜種植區(qū)進(jìn)行根腫病發(fā)病率進(jìn)行普查，而且可為農(nóng)民的耕作方式提出指導(dǎo)，通過適當(dāng)?shù)妮喿鬟_(dá)到防治根腫病的目的，具有十分重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。 本文從四川雙流縣蔬菜種植基地，感染根腫菌的油菜等十字花科作物中分離、提純孢子，探索了根腫孢子侵染粘附過程中的影響因素以及

3、用ELISA方法初步摸索了檢測土壤或者病根組織孢子濃度的方法，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.優(yōu)化了密度梯度離心提純孢子的方法，應(yīng)用檢測雜菌含量方法檢驗(yàn)提純效果。優(yōu)化的30/40/50/60％蔗糖濃度梯度配比密度梯度離心方法得到孢子效果最好，所得孢子層純度較高，但得率低；30％/60％和30％/50％得率相對較高，但樣品純度差些。 2.首次結(jié)合超聲波方法解決了孢子樣品中雜菌污染和樣品不均勻的問題。本實(shí)驗(yàn)采用了密度梯度與超聲

4、波相結(jié)合的方法有效的去除了孢子群表面絮狀粘連，優(yōu)化后的超聲波處理孢子最佳的條件為345w功率下10min、pH 5.5左右、添加0.5％的二甲基亞砜、孢子濃度約為7×10<'8>條件時(shí)，孢子數(shù)量達(dá)到最高、均勻度最好，雜菌數(shù)量和種類分別減少了51％和75％以上。破碎50min左右時(shí)孢子破碎率能夠穩(wěn)定的達(dá)到90％以上，基本去除雜菌，為獲得高純度的均勻分布的休眠孢子提供了新方法和思路。 3.完成了根腫菌的形態(tài)和生物學(xué)鑒定。通過形態(tài)學(xué)方

5、法觀察到病菌大量密集、似魚卵狀的休眠孢子囊堆和單個(gè)休眠孢子。通過休眠孢子復(fù)感染植物實(shí)驗(yàn)表明提純出的休眠孢子仍具有活性和致病性，證實(shí)了采集的樣品病癥為十字花科根腫病感染所致。 4.首次構(gòu)建了醋酸地衣紅染色法區(qū)分萌發(fā)孢子和未萌發(fā)孢子的檢測方法，為研究影響根腫游動(dòng)孢子的粘附能力的因素和孢子萌發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)孢子的粘附能力受蛋白質(zhì)變性劑和蛋白酶E的影響，推斷與粘附有關(guān)的可能為蛋白質(zhì)類物質(zhì)。 5.完成了休眠孢子抗體制備及土壤靈

6、敏度檢測實(shí)驗(yàn)。使用改良后的提純方法得到的樣品作為高純度抗原，通過兔背部皮下多點(diǎn)注射免疫法制備了高價(jià)免疫血清。土壤分離微生物交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明得到的免疫血清抗體含量和純度都能滿足實(shí)驗(yàn)要求。選取不同的土壤樣品進(jìn)行檢測，間接ELISA方法檢測靈敏度為：感染植物根懸液孢子最低檢出濃度為1×10<'2>個(gè)／mL，人工感染土壤和自然感染土壤1×10<'4>個(gè)／mL具有檢測敏感性，為構(gòu)建檢測免疫試劑盒，提供快速、準(zhǔn)確、方便的檢測方法提供了可行性依據(jù)。