類(lèi)人膠原蛋白Ⅰ的分離純化及其功能特性的研究.pdf

1、本文對(duì)類(lèi)人膠原蛋白Ⅰ(HCB Ⅰ)的分離純化及其功能特性進(jìn)行了研究。收集基因工程菌．Escherichia coli BL 21高密度發(fā)酵后的菌體，經(jīng)高壓勻漿破碎、沉淀、超濾、離子交換層析后，得到高純度的目標(biāo)蛋白。 在細(xì)胞破碎階段，對(duì)高壓勻漿過(guò)程中的物理和化學(xué)因素：包括勻漿壓力，勻漿次數(shù)，菌體濃度，懸浮體系做了系統(tǒng)研究。確定工藝為：菌體濃度15％，蒸餾水懸浮，在80MPa壓力下連續(xù)高壓勻漿兩次，每次通過(guò)勻漿機(jī)的裂解液用冰浴冷卻。

2、 在沉淀階段，采用L<,16>(4<'5>)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定沉淀的最佳參數(shù)為：pH值2.8，NaCl濃度3％，溫度18℃，蛋白濃度5g·L<'-1>。 在超濾階段，采用截留分子量為30kD的超濾膜包對(duì)沉淀后的上清進(jìn)行超濾，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)確定參數(shù)為：進(jìn)料濃度為0.2％，操作壓力為0.3MPa，進(jìn)料流量為3 L·min<'-1>，溫度為25℃，pH值為3。 在層析階段，先用CM-1吸附雜蛋白，上樣濃度為4mg·mL

3、<'-1>，吸附時(shí)間為1h，緩沖液為pH值為6.5、濃度為20mmol·L<'-1>的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含0.03 mol·L<'-1>的NaCl；再用 Fracogel EMD DEAE吸附目標(biāo)蛋白，上樣濃度為4mg·mL<'-1>，緩沖液為pH8.0、50 mmol·L<'-1>的Tris-HCl溶液，以 3.0 mL·minL<'-1>的流速過(guò)柱吸附，采用逐次洗脫方法洗脫。 最終得到純度為96.8％的類(lèi)人膠原蛋白Ⅰ，回收率為