羅氏海盤車（Asterias Rollestoni）體壁膠原蛋白的分離純化及其部分生物學功能的研究.pdf

1、羅氏海盤車是一種廣泛分布于我國沿海地區(qū)的海星綱棘皮動物，其體壁中含有豐富的膠原蛋白。膠原蛋白作為細胞外基質中起支持作用的主要成分，具有“Gly-X-Y”的特異性氨基酸組成和螺旋結構，因其還具有抗原性低、可生物降解性強、生物相容性好等優(yōu)點，故在生物學、醫(yī)學、食品科學和美容業(yè)等領域中具有巨大的研究開發(fā)潛力和廣闊的應用前景。 國內外對膠原蛋白的分離制備主要以哺乳動物皮膚、軟骨以及魚類皮膚等組織為原料，對其研究主要集中在分離制備和生物材

2、料領域的開發(fā)應用方面。到目前為止，對棘皮動物膠原蛋白的研究仍比較少，而對羅氏海盤車體壁膠原蛋白的分離純化及其生物學功能還未見報道。為了充分開發(fā)和利用我國沿海豐富的海盤車資源，建立羅氏海盤車體壁膠原蛋白的分離制備和純化方法，查清其對體外培養(yǎng)的角膜細胞、皮膚細胞和腫瘤細胞的生物學功能，探索其在臨床眼科、醫(yī)學美容和腫瘤生物學應用的可能性，本文以羅氏海盤車體壁為原料，利用改良的酶解法分離純化出了膠原蛋白，并用所得膠原蛋白純化樣品對體外培養(yǎng)的角膜

3、細胞、皮膚細胞和腫瘤細胞進行了生物學功能研究，獲得了較好的效果。為利用海盤車體壁膠原蛋白研制角膜組織工程支架材料、美容材料和抗腫瘤研究奠定了理論基礎和技術條件，具有重要的科學意義和巨大的開發(fā)價值。 本文首先分別采用酸抽提法、中性鹽抽提法和酶解法從羅氏海盤車體壁中提取膠原蛋白，通過將三種方法進行比較，發(fā)現(xiàn)酶解法提取結果明顯高于酸抽提法和中性鹽抽提法。所以，在對酶解法提取步驟進行了適當?shù)母牧己螅瑢⑵渥鳛樽罱K抽提方法。所提膠原蛋白產(chǎn)物

4、經(jīng)凝膠柱純化后，對該純化樣品進行生化性質的測定，并將其作為細胞培養(yǎng)添加物檢測其對家兔角膜基質細胞(RCK)、新西蘭大白兔角膜內皮(NCE)細胞、人胚胎皮膚成纖維細胞(ESF)和HeLa細胞的生物學功能。 生化性質的測定結果表明，所得膠原蛋白純化樣品由分子量分別為87.9kDa和84.OkDa的兩種α鏈組成，產(chǎn)物中蛋白含量為97.5％，羥脯氨酸含量為9.75％，多糖含最為0.6％。 所得膠原蛋白純品對體外培養(yǎng)角膜細胞的生物

5、學功能實驗結果顯示：不同濃度的膠原蛋白作為角膜內皮和基質細胞培養(yǎng)液添加物均可不同程度提高細胞的貼壁速率和增殖速率，其中l(wèi)mg／mL和10mg／mL濃度膠原蛋白促角膜細胞貼壁和促增殖作用明顯。 膠原蛋白純品對體外培養(yǎng)皮膚成纖維細胞的生物學功能實驗結果顯示，實驗組中不同濃度膠原蛋白均可促進皮膚成纖維細胞貼壁速率，其中10mg／mL濃度和30mg／mL濃度膠原蛋白促皮膚成纖維細胞貼壁作用顯著。不同濃度膠原蛋白對皮膚成纖維細胞增殖影響的

6、實驗結果顯示，不同濃度膠原蛋白均不同程度促進皮膚成纖維細胞增殖速率，其中10mg／mL濃度膠原蛋白促皮膚成纖維細胞增殖作用顯著。 膠原蛋白純品對HeLa細胞生物學功能試驗結果顯示，不同濃度膠原蛋白均可促進HeLa細胞的貼壁速率和增殖速率，其中10mg／mL濃度和60mg／mL濃度膠原蛋白促HeLa細胞貼壁作用顯著，10mg／mL濃度膠原蛋白促HeLa細胞增殖作用顯著。 由以上結果可知，所提膠原蛋白純品作為細胞培養(yǎng)添加物對