2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩123頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、目的:
  細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)是機(jī)體多種細(xì)胞因子如白介素-1β(IL-1β)、IL-6和γ-干擾素(IFN-γ)等迅速大量產(chǎn)生的現(xiàn)象,可引發(fā)多器官衰竭。其中,IL-1β是一種非常重要的促炎性細(xì)胞因子。在多種炎性疾病例如家族性地中海熱、家族性寒冷型自身炎癥綜合征、先天性多系統(tǒng)炎性疾病和高免疫球蛋白D綜合征,以及髓性白血病中IL-1β分泌升高。對IL-1β的分泌機(jī)制進(jìn)行深入研究,對于臨床如何控制細(xì)胞因子風(fēng)暴將

2、具有重要的指導(dǎo)意義。
  關(guān)于IL-1β的分泌,目前所知有限。IL-1β有兩種形式:首先在胞漿內(nèi)以無活性的proIL-1β形式(31kDa)被翻譯出來,然后被caspase-1剪切成有活性的matureIL-1β(17kDa)并分泌到胞外。前人的研究已經(jīng)證實IL-1β缺乏信號肽,無法通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體經(jīng)典分泌途徑分泌到胞外。細(xì)胞免疫熒光染色顯示IL-1β均勻分布在細(xì)胞漿中,我們推測胞膜上的廣泛存在的各類轉(zhuǎn)運體(transport

3、ers)是IL-1β的主要分泌途徑。本研究的主要目的是篩選與IL-1β分泌相關(guān)的轉(zhuǎn)運體,并對相關(guān)分泌機(jī)制進(jìn)行較為深入的研究。
  方法:
  1.白介素-1β在單核、巨噬及中性粒細(xì)胞中分泌檢測
  1.1獲取人源性和鼠源性的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞
  獲取人外周血原代單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞;使用丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)分化THP-1細(xì)胞得到人源性巨噬細(xì)胞;獲取小鼠腹腔和骨髓巨噬細(xì)胞;培養(yǎng)小鼠巨噬

4、細(xì)胞株RAW264.7和J774A.1細(xì)胞;獲取小鼠腹腔和骨髓中性粒細(xì)胞;培養(yǎng)和分化HL60細(xì)胞成為人源性中性粒細(xì)胞。使用Wright-Giemsa染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測獲取的細(xì)胞純度。
  1.2IL-1β檢測
  使用1μg/ml LPS4h和/或ATP1mM45rmin進(jìn)行細(xì)胞刺激,設(shè)置三組:無處理細(xì)胞組(Untreated cells,UT),LPS單刺激組(L),LPS+ATP雙單刺激組(LA)。使用ELISA,We

5、stem Blotting和細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行上清IL-1β以及胞漿內(nèi)IL-1β檢測。
  2.篩選白介素-1β分泌相關(guān)的轉(zhuǎn)運體
  2.1篩選可抑制IL-1β分泌的轉(zhuǎn)運體
  在人外周血原代巨噬細(xì)胞、THP-1細(xì)胞分化來源巨噬細(xì)胞和FVB wild type(FVBwt)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中,使用MRP1、BCRP、P-gp、OATP1B1和MATE轉(zhuǎn)運體抑制劑進(jìn)行IL-1β分泌抑制實驗。
  2.2MRP1轉(zhuǎn)運

6、體功能驗證和表達(dá)檢測
  使用轉(zhuǎn)運體抑制劑處理細(xì)胞,將10μg/ml終濃度的SNARF1孵育細(xì)胞30分鐘后胞吐7小時,使用流式細(xì)胞儀檢測SNARF1胞漿內(nèi)滯留程度驗證MRP1轉(zhuǎn)運體功能。使用流式細(xì)胞儀,Western Blotting和細(xì)胞免疫熒光法檢測MRP1蛋白的表達(dá)。
  2.3MRP1基因敲除小鼠中IL-1β分泌檢測
  同性別、同年齡的FVBwt小鼠作為MRP1 Knock Out(MRP1ko)小鼠的陰性對

7、照。培養(yǎng)FVBwt和MRP1ko小鼠骨髓巨噬細(xì)胞,進(jìn)行IL-1β分泌檢測。
  3.阻滯白介素-1β與炎癥小鼠生存率的關(guān)系
  3.1腹膜炎小鼠造模
  調(diào)整LPS濃度,分別設(shè)置未處理組、1mg/kg組、1.5mg/kg組、2mg/kg組、5mg/kg組、10mg/kg組和50mg/kg組,每組1ml液體注射到小鼠腹腔中。
  3.2MRP1腹膜炎小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子濃度檢測
  使用LPS1mg/kg腹腔注射

8、小鼠,設(shè)置未處理組、刺激6小時組、刺激2天組、刺激6天組、刺激13天組和刺激27天組。獲取小鼠外周血和小鼠腹腔液的樣本,檢測以下32種細(xì)胞因子:Eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、 IL-13、 IL-15、IL-17、IP-10、KC、LIF、LIX、MCP-1、M-C

9、SF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、RANTES、TNF-α和VEGF。
  3.3小鼠生存率實驗
  使用FVBwt小鼠檢測LPS致死劑量,設(shè)置LPS5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg和50mg/kg組進(jìn)行濃度檢測。所有小鼠均注射LPS,然后用anakinra745mg/kg或/和IL-18 BPd1mg/kg雙重拮抗IL-1β或/和IL-18,同時設(shè)置未注射任何拮抗劑組作為對照,觀察小鼠生存情

10、況。
  4.胞漿內(nèi)白介素-1β谷胱甘肽化修飾檢測
  使用BioGEE對胞內(nèi)所有谷胱甘肽化的蛋白進(jìn)行標(biāo)記,裂解細(xì)胞。使用羊抗人IL-1β抗體通過免疫共沉淀pull-down細(xì)胞裂解液中的IL-1β蛋白,兔抗人IL-1β抗體Western Blotting驗證pull-down效果。使用streptavidin-HRP進(jìn)行WesternBlotting,檢測胞內(nèi)IL-1β的谷胱甘肽化水平。
  結(jié)果:
  1.白

11、介素-1β在單核、巨噬及中性粒細(xì)胞中分泌情況
  1.1成功獲取了各類人源性和鼠源性的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞
  我們成功獲取人外周血原代單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞;使用PMA分化THP-1細(xì)胞得到了人源性巨噬細(xì)胞;獲取了小鼠腹腔和骨髓巨噬細(xì)胞;培養(yǎng)了小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7和J774A.1細(xì)胞;獲取了小鼠腹腔和骨髓中性粒細(xì)胞;培養(yǎng)并分化HL60細(xì)胞成為人源性中性粒細(xì)胞。
  1.2IL-1β分泌情況

12、
  單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞僅需要LPS單刺激便可以分泌IL-1β,原代巨噬細(xì)胞需要LPS+ATP雙重刺激才可以分泌IL-1β。 THP-1細(xì)胞株來源的人巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的能力極為強(qiáng)大,上清中可同時見大量matureIL-1β和proIL-1β被分泌出來。THP-1分化來源的巨噬細(xì)胞、J774A.1細(xì)胞株和RAW264.7細(xì)胞株可以分泌proIL-1β。
  2.抑制MRP1轉(zhuǎn)運體降低白介素-1β分泌
  2.1M

13、RP1轉(zhuǎn)運體可抑制IL-1β分泌
  MRP1、BCRP、P-gp、OATP1B1和MATE轉(zhuǎn)運體抑制劑發(fā)現(xiàn),抑制MRP1功能后IL-Iβ分泌顯著降低。
  2.2MRP1轉(zhuǎn)運體功能正常并在細(xì)胞膜上分布
  SNARF1胞漿內(nèi)滯留實驗表明MRP1轉(zhuǎn)運體抑制劑確實特異性地抑制MRP1轉(zhuǎn)運體功能。使用流式細(xì)胞術(shù),Western Blotting和細(xì)胞免疫熒光法均在目標(biāo)細(xì)胞中檢測MRP1蛋白的表達(dá),MRP1轉(zhuǎn)運體分布在細(xì)胞膜

14、上。
  2.3MRP1基因敲除小鼠分泌matureIL-1β能力降低
  在小鼠M0骨髓巨噬細(xì)胞中,MRP1ko和FVBwt小鼠比較,MRP1ko小鼠M0細(xì)胞分泌matureIL-1β能力低于FVBwt小鼠M0細(xì)胞,兩者呈顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.044)。
  3.阻滯白介素-1β提高炎癥小鼠生存率
  3.1腹膜炎小鼠造模成功
  LPS1mg/kg可以成功引發(fā)小鼠腹膜炎,這個劑量注射后的小鼠可以存活超

15、過一個月。5mg/kg和10mg/kg屬于亞致死劑量,而50mg/kg屬于致死劑量?;加懈鼓ぱ椎男∈?,許多種類的炎癥因子都上升,包括IL-1β。
  3.2小鼠生存率實驗
  選取LPS15mg/kg用于小鼠生存率檢查。與未拮抗的對照組比較,anakinra745mg/kg拮抗組、anakinra745mg/kg和IL-18BPd1mg/kg雙重拮抗組均能改善小鼠生存率。因小鼠樣本過少,組間數(shù)據(jù)比較未能得到顯著性差異。

16、>  4.胞漿內(nèi)IL-1β可被谷胱甘肽化修飾
  兔抗人IL-1β抗體的Western Blotting結(jié)果表明目標(biāo)蛋白已被成功pull down,streptavidin-HRP抗體的Western Blotting結(jié)果表明胞內(nèi)IL-1β被谷胱甘肽化。
  結(jié)論:
  (1)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞僅需要LPS單刺激便可以分泌matureIL-1β,巨噬細(xì)胞需要LPS+ATP雙重刺激才可以分泌matureIL-1β。TH

17、P-1分化的人源巨噬細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞株J774A.1細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞可以分泌proIL-1β。
  (2)MRP1轉(zhuǎn)運體分布在細(xì)胞膜上,是matureIL-1β的分泌通路之一。
  (3)炎癥狀態(tài)下,matureIL-1β分泌增多。對matureIL-1β進(jìn)行阻滯,可提高炎癥小鼠的生存率。
  (4)細(xì)胞內(nèi)IL-1β可被谷胱甘肽化修飾。谷胱甘肽化修飾后的蛋白是MRP1轉(zhuǎn)運體的運輸?shù)孜?。MRP1轉(zhuǎn)運體可能通過

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論