miR-92a在胃粘膜腸上皮化生中調(diào)控CDX2的作用與機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　胃粘膜腸上皮化生是胃癌最常見(jiàn)的癌前病變之一。大多數(shù)研究者公認(rèn)的從慢性萎縮性胃炎,到胃粘膜腸上皮化生,再到非典型增生進(jìn)而演變?yōu)槲赴┑陌l(fā)展模式中,胃粘膜腸上皮化生是非常重要甚至不可或缺的一環(huán)。然而胃粘膜腸上皮化生的發(fā)生機(jī)制目前尚未闡明。膽汁酸刺激是胃粘膜腸上皮化生發(fā)生的一個(gè)重要的內(nèi)源性因素。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),伴有膽汁反流的病人比不伴有膽汁反流的病人胃粘膜發(fā)生腸上皮化生的風(fēng)險(xiǎn)高11倍。臨床研究表明,反流液中的膽汁酸刺激可能是導(dǎo)致食

2、管腸上皮化生的主要原因。
　　尾側(cè)同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(Caudal-related Homeobox2,CDX2)屬于尾側(cè)同源盒基因家族的一員,能促進(jìn)多種腸細(xì)胞特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄,在維持腸道細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化等方面發(fā)揮了不可替代的作用。CDX2的顯著激活被認(rèn)為是胃粘膜腸上皮化生的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn),與正常胃粘膜相比,腸化生的組織顯著表達(dá)原本不表達(dá)的CDX2;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CDX2轉(zhuǎn)基因小鼠胃粘膜100％發(fā)生了腸上皮化生。胃粘膜腸上

3、皮化生是胃癌最常見(jiàn)的癌前病變之一。大多數(shù)研究者公認(rèn)的從慢性萎縮性胃炎,到胃粘膜腸上皮化生,再到非典型增生進(jìn)而演變?yōu)槲赴┑陌l(fā)展模式中,胃粘膜腸上皮化生是非常重要甚至不可或缺的一環(huán)。然而胃粘膜腸上皮化生的發(fā)生機(jī)制目前尚未闡明。膽汁酸刺激是胃粘膜腸上皮化生發(fā)生的一個(gè)重要的內(nèi)源性因素。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),伴有膽汁反流的病人比不伴有膽汁反流的病人胃粘膜發(fā)生腸上皮化生的風(fēng)險(xiǎn)高11倍。臨床研究表明,反流液中的膽汁酸刺激可能是導(dǎo)致食管腸上皮化生的主要原因。

4、>　　尾側(cè)同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(Caudal-related Homeobox2,CDX2)屬于尾側(cè)同源盒基因家族的一員,能促進(jìn)多種腸細(xì)胞特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄,在維持腸道細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化等方面發(fā)揮了不可替代的作用。CDX2的顯著激活被認(rèn)為是胃粘膜腸上皮化生的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn),與正常胃粘膜相比,腸化生的組織顯著表達(dá)原本不表達(dá)的CDX2;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CDX2轉(zhuǎn)基因小鼠胃粘膜100%發(fā)生了腸上皮化生。然而CDX2在胃粘膜腸上皮化生中表達(dá)上調(diào)

5、的機(jī)制尚未闡明。
　　MicroRNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的一類(lèi)重要的調(diào)控分子,它通過(guò)與靶基因信使RNA(mRNA)的3’非編碼區(qū)(3’-UTR)特異性的堿基配對(duì)引起mRNA的降解或翻譯抑制,從而發(fā)揮對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默作用。miRNA在消化道發(fā)生、發(fā)育、分化及成形過(guò)程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。那么對(duì)于胃粘膜腸上皮化生這樣一種同細(xì)胞分化和組織發(fā)育密切相關(guān)的病變,miRNA是否也參與其調(diào)控呢?
　　我們通過(guò)用膽汁酸刺

6、激胃上皮細(xì)胞,建立了胃粘膜腸上皮化生的細(xì)胞模型;進(jìn)而用此細(xì)胞模型與正常的胃粘膜上皮細(xì)胞進(jìn)行 microRNA微芯片分析,篩選出一批表達(dá)差異性顯著的miRNA分子。其中,miR-92a的表達(dá)上升最為顯著。隨后,我們建立了miR-92a的功能獲得與缺失模型,并對(duì)miR-92a的功能進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-92a后,CDX2在mRNA和蛋白水平上均出現(xiàn)了明顯上調(diào),反之亦然。那么,miR-92a是否參與了胃粘膜腸上皮化生中CDX2的調(diào)控?

7、其發(fā)揮作用的靶基因又是什么?本課題將圍繞以上問(wèn)題展開(kāi)論述。
　　【目的】
　　1、建立、選優(yōu)與鑒定膽汁酸誘導(dǎo)的胃上皮細(xì)胞腸化生模型;2、篩選腸上皮化生的細(xì)胞模型與正常的胃粘膜上皮細(xì)胞中差異性表達(dá)的miRNA分子(即miR-92a);3、建立miR-92a的功能獲得與缺失模型;4、篩選并驗(yàn)證miR-92a上調(diào)CDX2表達(dá)的靶基因。
　　【方法】
　　1、選用不同的時(shí)間點(diǎn)、采用不同濃度的膽汁酸刺激正常的胃粘膜上皮細(xì)胞

8、,用quantitative Real Time-Polymerase Chain Reaction(qRT-PCR)方法檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志分子的表達(dá),從而選取模型建立的最優(yōu)化的刺激時(shí)間和濃度;在此條件下,通過(guò)western blot和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定膽汁酸誘導(dǎo)的胃上皮細(xì)胞腸化生模型。
　　2、采用microRNA微芯片技術(shù),分析比較膽汁酸誘導(dǎo)的胃腸化細(xì)胞模型和正常對(duì)照細(xì)胞,篩選出表達(dá)差異顯著的miRNA分子(miR-92a)。

9、r>　　3、利用miR-92a的類(lèi)似物和抑制物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,采用qRT-PCR和western blot檢測(cè)miR-92a對(duì)CDX2表達(dá)的調(diào)控作用。
　　4、聯(lián)合多個(gè)miRNA靶分子數(shù)據(jù)庫(kù)篩選與miR-92a有潛在結(jié)合位點(diǎn)的分子。
　　5、運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和western blot驗(yàn)證miR-92a上調(diào)CDX2表達(dá)的靶基因。
　　【結(jié)果】
　　1.成功構(gòu)建、選優(yōu)與鑒定了膽汁酸誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞腸化生模型

10、　　采用四種含有特定濃度的膽汁酸:膽酸(CA),脫氧膽酸(DCA),鵝脫氧膽酸(CDCA)及脫氫膽酸(DHCA)刺激永生化的胃粘膜上皮細(xì)胞,在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)(0 h、3h、6 h、9h、12 h、24 h、48h)收獲細(xì)胞,qRT-PCR結(jié)果顯示,在經(jīng)膽汁酸刺激后,腸上皮特異分子KLF4、VILLIN及MUC2的mRNA表達(dá)均顯著升高,升高倍數(shù)為對(duì)照組的20至1000倍不等;且升高水平同刺激濃度和時(shí)間正相關(guān)。在4種膽汁酸刺激模型間橫向比

11、較,CDCA刺激引起腸上皮特異分子升高的倍數(shù)明顯高于其他膽汁酸;在同一膽汁酸模型中將不同刺激時(shí)間和濃度節(jié)點(diǎn)進(jìn)行縱向比較,從150μM、第24小時(shí)開(kāi)始,腸上皮特異分子的升高進(jìn)入平臺(tái)期。據(jù)此,我們選擇了CDCA刺激24小時(shí)作為最終優(yōu)選后的腸化模型進(jìn)行進(jìn)一步研究。我們利用Western blot和免疫熒光分別檢測(cè)了腸上皮特異分子KLF4、VILLIN及MUC2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)這幾種分子在經(jīng)過(guò)CDCA刺激后,蛋白表達(dá)均顯著升高。這些結(jié)果表明,胃上皮

12、細(xì)胞經(jīng)膽汁酸刺激后,基因型發(fā)生一系列變化,開(kāi)始表達(dá)腸上皮標(biāo)志分子,可以作為胃粘膜腸上皮化生的細(xì)胞模型。
　　2.miR-92a在microRNA微芯片結(jié)果中上升最為顯著
　　通過(guò)microRNA微芯片分析比較膽汁酸誘導(dǎo)腸化生模型細(xì)胞與正常對(duì)照細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)1087種上調(diào)的miRNA分子,120種下調(diào)的miRNA分子,其中miR-92a的表達(dá)水平上升最為顯著。這一結(jié)果在CDCA誘導(dǎo)的GES-1和BGC823細(xì)胞中得到了驗(yàn)證。qRT

13、-PCR結(jié)果顯示,GES-1和BGC823細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)水平呈時(shí)間依賴(lài)性上升趨勢(shì),升高倍數(shù)為對(duì)照組的5至20倍不等。隨后我們?cè)谟郎奈刚衬ど掀ぜ?xì)胞及多種胃癌細(xì)胞系中采用qRT-PCR檢測(cè)miR-92a的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與永生化胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1相比,AGS、SGC7901和BGC823細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)水平較高;而在MKN45、GC9811和KATDⅢ細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較低,MKN28中表達(dá)最低,幾乎檢測(cè)不到。

14、r>　　3.miR-92a能夠上調(diào)CDX2的表達(dá)
　　我們進(jìn)一步采用miR-92a的類(lèi)似物mimics和抑制物inhibitor轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞和BGC823細(xì)胞,建立了功能獲得和缺失模型。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá) miR-92a后,CDX2在mRNA水平上的表達(dá)呈升高趨勢(shì),其升高程度與miR-92a的上調(diào)幅度正相關(guān);CDX2及其下游腸道特異性基因 Sucrose-Isomaltase(S-I)在蛋白水平的表達(dá)出現(xiàn)了類(lèi)似的

15、結(jié)果,其表達(dá)升高與miR-92a上調(diào)水平正相關(guān)。抑制miR-92a的表達(dá)后出現(xiàn)了相反的結(jié)果。上述結(jié)果表明,miR-92a可能是通過(guò)上調(diào)CDX2的表達(dá)從而在胃粘膜腸上皮化生中發(fā)揮作用。
　　4.miR-92a通過(guò)結(jié)合Foxd1的3’-UTR抑制Foxd1的表達(dá)
　　為研究miR-92a上調(diào)CDX2表達(dá)的機(jī)制,我們聯(lián)合采用miRwalk和miRanda兩個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)庫(kù),預(yù)測(cè)出 miR-92a可能的靶基因,將上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到的

16、結(jié)果取交集,我們得到了163種miR-92a可能的靶基因。通過(guò)進(jìn)一步功能分析及查閱文獻(xiàn),我們將研究興趣放在了Forkhead box家族成員轉(zhuǎn)錄因子Foxd1上。我們隨后采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),miR-92a通過(guò)結(jié)合Foxd13’-UTR的結(jié)合位點(diǎn),從而影響Foxd1的表達(dá)。我們進(jìn)一步在GES-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-92a的類(lèi)似物,利用western blot和qRT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-92a能夠下調(diào)Foxd1蛋白的表達(dá)水