腸上皮化生和胃癌中CDX2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其意義的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的： 胃癌是指來(lái)源于胃粘膜上皮和腺上皮的惡性腫瘤，在胃的惡性腫瘤中胃癌約占95%。胃癌是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤的發(fā)病率中占第二位，是嚴(yán)重危害人類生命健康的惡性疾病之一。同其他腫瘤一樣，胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，是多種改變?cè)诩?xì)胞內(nèi)累積，從量變到質(zhì)變的過(guò)程。Correa總結(jié)了胃癌流行病病因?qū)W的研究結(jié)果，提出人腸型胃癌的發(fā)生模式：正常胃粘膜-慢性淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-異型增生-早期

2、癌-進(jìn)展期癌。胃粘膜腸上皮化生（又稱腸化生）是指胃粘膜上皮及腺上皮在病理情況下轉(zhuǎn)變?yōu)槟c粘膜上皮及腺上皮。胃粘膜腸上皮化生是胃癌發(fā)生過(guò)程中重要的步驟。 胃粘膜腸上皮化生向胃癌進(jìn)展的過(guò)程與多種基因有關(guān)。尾型同源異形盒基因CDX2（caudaltypehomeoboxgene2）屬于同源盒基因（homeoboxgenes，Hoxgenes）家族中一員，最早是由Mlodzik于果蠅中分離成功，它是腸道特異性轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育中其表達(dá)產(chǎn)

3、物廣泛存在于胚胎消化道腺上皮中，對(duì)于后部體節(jié)和消化道的形成、發(fā)育和成熟起重要作用，在出生后，正常情況下在胃粘膜上皮中不表達(dá)，廣泛表達(dá)于小腸及結(jié)腸粘膜，對(duì)腸上皮的分化以及形態(tài)和功能的維持也具有決定性的意義。有研究顯示CDX2在慢性萎縮性胃炎相關(guān)的腸上皮化生中高表達(dá)并在部分胃癌中表達(dá)，表明其有可能與胃粘膜向腸上皮轉(zhuǎn)化及胃粘膜癌變發(fā)生有關(guān)。 現(xiàn)代分子生物學(xué)認(rèn)為，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)共同調(diào)控生物信息的表達(dá)，遺傳信息提供了“生產(chǎn)”所必需蛋白

4、質(zhì)的“藍(lán)本”，而表觀遺傳學(xué)則指示細(xì)胞怎樣、何時(shí)和何地表達(dá)這些信息。表觀遺傳學(xué)是指在不影響基因序列的情況下由DNA的甲基化/去甲基化及組蛋白的乙酰化/去乙?；煌瑺顟B(tài)引起基因的表達(dá)改變。DNA甲基化指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferases，DNMTs）介導(dǎo)，在CpG二核苷酸胞嘧啶5位碳原子上加入一甲基基團(tuán)，使之變成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化學(xué)反應(yīng)，生物學(xué)功能主要表現(xiàn)為在序列不變的情況下，控制基因表達(dá)，維護(hù)染色體

5、的完整性和調(diào)節(jié)重組及某些特定基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性。與突變等遺傳學(xué)基因異常不同的是，抑癌基因的高甲基化狀態(tài)是可逆的，應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑將處于甲基化狀態(tài)的基因進(jìn)行去甲基化激活，可以恢復(fù)某些關(guān)鍵性抑癌基因的功能而起到預(yù)防和治療腫瘤的作用，為我們進(jìn)一步研究去甲基化試劑抗腫瘤提供了很好的依據(jù)，所以抑癌基因的甲基化研究不僅對(duì)惡性腫瘤的病因、早期診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)有很大價(jià)值，而且對(duì)腫瘤的基因治療研究有著不可替代的作用。 目前，有關(guān)CDX2在胃癌

6、、大腸癌、食管癌等腫瘤中的異常甲基化也有報(bào)道，并推測(cè)其與腫瘤的治療、預(yù)后有關(guān)。但目前對(duì)胃粘膜腸上皮化生中的CDX2基因CpG島甲基化狀態(tài)的研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)CDX2基因在不同亞型腸上皮化生和胃癌中的表達(dá)和甲基化狀態(tài)，及其與臨床特點(diǎn)的關(guān)系，初步探討了CDX2在腸上皮化生向胃癌轉(zhuǎn)變過(guò)程中的作用及機(jī)制。內(nèi)容包括： 1．CDX2在腸上皮化生和胃癌中的蛋白表達(dá)； 2．CDX2在腸上皮化生和胃癌中的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)；

7、3．5-aza-CdR對(duì)人胃癌細(xì)胞KATO-Ⅲ和AGS中CDX2mRNA表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的影響。 材料和方法： （一）材料 1．2008年3月至2008年7月期間于南方醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心因上腹部不適、早飽、噯氣等癥狀行胃鏡檢查并病理診斷腸上皮化生患者53例，其中男37例，女16例，年齡35-74歲，平均57歲。另取18例無(wú)主觀癥狀且病理檢查排除IM及胃癌的健康檢查者胃粘膜。每例均于距幽門(mén)口1-2cm處活組織檢

8、查。胃癌組織來(lái)自于同時(shí)期南方醫(yī)院手術(shù)切除組織。所有標(biāo)本均于離體后20min內(nèi)獲取，一部分制作蠟塊，另一部分液氮速凍，然后放置于-80℃保存。所有患者均無(wú)已知嚴(yán)重的心臟、肝腎功能不全以及精神病史，胃癌患者手術(shù)前未接受化療或放射治療。所有患者均知情同意。 2．人胃癌細(xì)胞株KATO-Ⅲ和AGS，來(lái)自于ATCC。 （二）方法 1．運(yùn)用高鐵二銨-愛(ài)先藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)（HID-AB-PAS）將腸上皮化生分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，按

9、照Lauren's分型將胃癌分為腸型和彌漫型； 2．運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)組織中CDX2蛋白表達(dá)情況； 3．采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）檢測(cè)組織中CDX2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。 4．RT-PCR和MSP分別檢測(cè)5-aza-CdR處理前后兩種胃癌細(xì)胞中CDX2mRNA表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。 （三）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13．0軟件包的X2檢驗(yàn)和方差分析等檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

10、 結(jié)果： （一）基本情況：正常胃粘膜18例，腸上皮化生53例，包括Ⅰ型22例，Ⅱ型18例，Ⅲ型13例。胃癌36例，包括腸型胃癌21例，彌漫型胃癌15例。 （二）CDX2的表達(dá)情況 1．CDX2在正常胃粘膜中不表達(dá)。不同亞型腸上皮化生中CDX2表達(dá)陽(yáng)性率（分別為Ⅰ型95．5%，Ⅱ型83．3%，Ⅲ型61．5%）有顯著差異（P=0．036），呈逐漸降低趨勢(shì)。胃癌中CDX2的陽(yáng)性表達(dá)率（52．8%）顯著低于腸上皮化

11、生（83．0%）（P=0．002），且與胃癌的組織學(xué)類型有關(guān)，腸型胃癌中CDX2陽(yáng)性表達(dá)率（71．4%）顯著高于彌漫型胃癌（26．7%）（P=0．008）。 2．腸上皮化生和胃癌病例中CDX2表達(dá)均主要集中于H．pylori感染陰性者，腸上皮化生中兩者列聯(lián)系數(shù)C=0．267，P=0．067，胃癌組織中兩者列聯(lián)系數(shù)為C=0．121，P=0．463，H．pylori感染對(duì)CDX2表達(dá)無(wú)影響。 3．胃癌中CDX2表達(dá)與年齡、性

12、別無(wú)關(guān)；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CDX2陽(yáng)性表達(dá)率（100．0%）顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（43．3%）（列聯(lián)系數(shù)C=0．390，P=0．020），但兩者關(guān)系不密切；CDX2與浸潤(rùn)深度的列聯(lián)系數(shù)C=0．317，P=0．106，提示腫瘤浸潤(rùn)深度與CDX2表達(dá)不相關(guān)。 （三）CDX2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 1．正常胃粘膜全部表現(xiàn)出CDX2啟動(dòng)子甲基化，腸上皮化生中CDX2啟動(dòng)子甲基化率為43．4%，（其中Ⅰ型22．7%，Ⅱ型55．6%，Ⅲ型61

13、．5%），顯著低于胃癌中CDX2啟動(dòng)子甲基化率（69．4%）（P=0．016），不同亞型腸上皮化生中CDX2啟動(dòng)子甲基化率也有顯著性差異（P=0．036）。CDX2啟動(dòng)子甲基化率在腸型胃癌中（66．7%，14/21）低于彌漫型（73．3%，11/15），但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05）。 2．胃癌中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CDX2啟動(dòng)子甲基化率（50．0%）低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（73．3%）（列聯(lián)系數(shù)C=0．185，P=0．343），但差異

14、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CDX2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與浸潤(rùn)深度的列聯(lián)系數(shù)C=0．323，P=0．041，提示腫瘤浸潤(rùn)深度與CDX2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)有關(guān)，且浸潤(rùn)越深，甲基化率越高，兩者的關(guān)系不密切。 3．腸上皮化生中CDX2啟動(dòng)子甲基化病例中CDX2表達(dá)陽(yáng)性率（36．4%）顯著低于非甲基化病例（列聯(lián)系數(shù)C=0．299，P=0．031），胃癌中CDX2啟動(dòng)子甲基化病例中CDX2表達(dá)陽(yáng)性率（47．4%）亦顯著低于非甲基化病例（94．1%）（列聯(lián)系數(shù)

15、C=0．452，P=0．002），CDX2啟動(dòng)子甲基化可導(dǎo)致CDX2表達(dá)減少。 （四）未經(jīng)5-aza-CdR去甲基化處理的胃癌細(xì)胞AGS內(nèi)發(fā)現(xiàn)CDX2mRNA的表達(dá)，啟動(dòng)子為非甲基化；而KATO-Ⅲ細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)CDX2mRNA的表達(dá)，啟動(dòng)子為甲基化。經(jīng)過(guò)5-aza-CdR藥物行去甲基化處理后KATO-Ⅲ細(xì)胞內(nèi)CDX2mRNA得到重新表達(dá)，啟動(dòng)子則轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆?結(jié)論： （一）CDX2在腸上皮化生向胃癌的轉(zhuǎn)化過(guò)程

16、中呈逐漸降低趨勢(shì)，可能起著抑制癌基因作用； （二）CDX2啟動(dòng)子甲基化是導(dǎo)致CDX2表達(dá)缺失的主要機(jī)制，表觀遺傳學(xué)機(jī)制是胃癌發(fā)生的重要分子機(jī)制。 （三）5-aza-CdR能通過(guò)使CDX2啟動(dòng)子去甲基化而使胃癌細(xì)胞KATO-Ⅲ中CDX2mRNA再次表達(dá)，CDX2基因啟動(dòng)子甲基化是使該基因失活的重要原因，去甲基化后該基因得到重新表達(dá)。通過(guò)藥物或其他手段對(duì)CDX2基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行調(diào)控達(dá)到對(duì)胃癌發(fā)生的抑制作用，從而有望在胃癌臨