Corin介導(dǎo)的pro-ANP活化途徑與糖尿病心肌病關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和/或作用缺陷所引起。隨著糖尿病發(fā)病率的逐年上升，其并發(fā)的糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）也日益受到人們重視。糖尿病心肌病是糖尿病常見的心血管并發(fā)癥，是糖尿病患者心力衰竭及猝死的首要原因，其典型臨床癥狀是心臟增大、心律失常，較易發(fā)生充血性心力衰竭，而其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清

2、楚。Corin是一種主要在心臟表達(dá)的絲氨酸蛋白酶，能夠高度特異的將心房鈉尿肽原（pro-atrial natriuretic peptide， pro-ANP）轉(zhuǎn)化為有活性的心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）。ANP是一種可以促進(jìn)腎臟排鈉、排水和舒張血管平滑肌的多肽類激素，主要在心房肌細(xì)胞中合成，其與心力衰竭和高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Corin基因缺失或表達(dá)減少與重大心血管疾病如心力衰

3、竭、心肌肥厚及高血壓等的發(fā)病密切相關(guān)。但心臟酶Corin介導(dǎo)的pro-ANP活化途徑在糖尿病心肌病中是否發(fā)揮作用，目前尚不清楚。因此，本課題采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）構(gòu)建的糖尿病心肌病SD大鼠動物模型、高糖誘導(dǎo)的乳鼠原代心肌細(xì)胞及高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞株，從整體、細(xì)胞、分子等不同層面，通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究，探討Corin介導(dǎo)的pro-ANP活化途徑與糖尿病心肌病之間的關(guān)系。
　　方法：
　　

4、1.一次性腹腔注射STZ構(gòu)建糖尿病SD大鼠動物模型；
　　2.超聲心動圖、血流動力學(xué)及大鼠心臟重量與體重的比值（心重/體重， HW/BW）檢測，以鑒定糖尿病心肌病SD大鼠動物模型；
　　3.透射電子顯微鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；
　　4.RT-PCR和Real-Time PCR檢測Corin及ANP mRNA在DCM大鼠心肌組織中的表達(dá)；
　　5.Western Blot和免疫組織化學(xué)檢測Corin及AN

5、P蛋白在DCM大鼠心肌組織中的表達(dá)；
　　6.Western Blot檢測Corin及ANP在注射STZ后第12、16、20和33周的DCM大鼠心肌組織中的表達(dá)；
　　7.ELISA檢測DCM大鼠血漿中N末端心房鈉尿肽原（N-terminal pro-atrial natriuretic peptide，NT-proANP）的濃度；
　　8.Real-Time PCR檢測Corin和ANP mRNA在高糖誘導(dǎo)的乳鼠原代

6、心肌細(xì)胞中的表達(dá)；
　　9.Western Blot和細(xì)胞免疫熒光染色檢測Corin和ANP蛋白在高糖誘導(dǎo)的乳鼠原代心肌細(xì)胞中的表達(dá)；
　　10.Western Blot檢測Corin和ANP蛋白在高糖誘導(dǎo)36 h、48 h和60 h的乳鼠原代心肌細(xì)胞中的表達(dá)；
　　11.Western Blot檢測Corin和ANP蛋白在高糖誘導(dǎo)36 h、48 h和60 h的H9c2心肌細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　

7、1.成功構(gòu)建糖尿病SD大鼠動物模型：STZ注射一周后，DCM組大鼠隨機(jī)血糖水平大于16.7 mmol/L，尿糖陽性，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象。與Ctrl組大鼠相比，DCM組大鼠隨機(jī)血糖水平明顯升高（P<0.01），體重明顯降低（P<0.01）。
　　2.成功構(gòu)建糖尿病心肌病SD大鼠動物模型：超聲心動圖檢查顯示，與Ctrl組大鼠相比，DCM組大鼠IVSd、LVPWd與LVIDd均減弱（P<0.05），LVIDs明顯升高（P<0.0

8、1），F(xiàn)S％與EF%均明顯降低（P<0.01）；血流動力學(xué)檢查結(jié)果顯示，DCM組大鼠+dp/dt與-dp/dt明顯低于Ctrl組（P<0.01），MABP無明顯差異（P>0.05）；DCM組HW/BW值明顯高于Ctrl組（P<0.01）；
　　3.在透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Ctrl組大鼠心肌組織肌纖維排列規(guī)則，心肌細(xì)胞形態(tài)正常，超微結(jié)構(gòu)完整，線粒體包膜完整，線粒體嵴分布均勻；而DCM組大鼠心肌組織肌纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞形態(tài)異常

9、，超微結(jié)構(gòu)改變明顯，線粒體包膜輪廓不清，亦可見線粒體包膜破損，線粒體嵴分布不均，線粒體嵴間距增大，甚至可見線粒體破潰死亡，可見較多糖原沉積；
　　4.大鼠心肌組織RT-PCR及Real-Time PCR結(jié)果顯示，DCM組Corin和ANP mRNA表達(dá)水平均明顯低于Ctrl組（P<0.05）；
　　5.大鼠心肌組織Western Blot及免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，DCM組Corin和ANP蛋白表達(dá)水平均明顯低于Ctrl組（P<

10、0.05）；
　　6.大鼠心肌組織Western Blot結(jié)果顯示，隨著DCM大鼠周齡的增加，Corin和ANP蛋白表達(dá)水平逐漸降低；
　　7.大鼠血漿ELISA結(jié)果顯示，DCM組血漿NT-proANP濃度明顯低于Ctrl組（P<0.01）；
　　8.乳鼠原代心肌細(xì)胞Real-Time PCR結(jié)果顯示，高糖（high glucose，HG）組誘導(dǎo)的乳鼠原代心肌細(xì)胞中Corin和ANP mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對照（

11、normal glucose，Ctrl）組（P<0.01）；
　　9.乳鼠原代心肌細(xì)胞Western Blot及細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，HG組Corin和ANP蛋白表達(dá)水平均明顯低于Ctrl組（P<0.05）；
　　10.乳鼠原代心肌細(xì)胞Western Blot結(jié)果顯示，隨著高糖環(huán)境誘導(dǎo)時間的延長， Corin和ANP蛋白表達(dá)水平逐漸降低；
　　11.H9c2心肌細(xì)胞株Western Blot結(jié)果顯示，隨著高糖環(huán)境誘