兩種肺動脈高壓模型中鈣穩(wěn)態(tài)失衡和水通道蛋白1介導(dǎo)肺動脈平滑肌表型改變的相關(guān)機制研究.pdf

1、【研究背景】肺動脈高壓(PH)是一類以肺動脈壓力與肺血管阻力增高為主要臨床特點的高風(fēng)險，高致死率綜合征。肺動脈壓力進行性增高，引發(fā)右心室肥厚，右心衰竭并最終導(dǎo)致死亡。肺動脈高壓時肺血管發(fā)生重構(gòu)，主要由遠端肺小動脈的遷移和異常增殖組成。肺小動脈的病理改變主要包括內(nèi)皮細胞損傷、動脈中膜平滑肌細胞的異常增殖與遷移和血管外膜結(jié)締組織增生。其中血管中膜肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的改變是介導(dǎo)遠端肺小動脈重塑的關(guān)鍵。在肺動脈高壓患者和慢性低氧性

2、肺動脈高壓（CHPH）動物模型中都發(fā)現(xiàn)，遠端PASMCs中，由鈣池操縱性鈣內(nèi)流（SOCE）導(dǎo)致細胞內(nèi)游離鈣離子（[Ca2+]i）濃度的異常升高介導(dǎo)了PASMCs的遷移和增殖。因此深入研究PASMCs異常增殖和遷移在 PH中的作用，可為新型有效藥物研究奠定基礎(chǔ)。
　　SU5416/低氧（SuHx）聯(lián)合誘導(dǎo)建立肺動脈高壓模型，是一種不可逆的重度肺動脈高壓模型。研究表明，慢性低氧環(huán)境下造模后，動物若返回常氧環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)，肺血管重塑現(xiàn)象

3、將會逐漸減退；且慢性低氧和野百合堿 PH模型均沒有檢測到增殖性功能失調(diào)的內(nèi)皮細胞。SU5416作為血管內(nèi)皮生長因子受體拮抗劑，可抑制腫瘤的血管生成；但在低氧刺激下 SU5416導(dǎo)致內(nèi)皮細胞凋亡后，會促使肺血管凋亡拮抗型內(nèi)皮細胞增殖并引起管腔閉塞。大鼠在 SU5416聯(lián)合低氧3周后，再飼養(yǎng)于常氧環(huán)境2周完成建模，其肺動脈壓力異常升高、血管閉塞性病變形成，均較CHPH模型嚴重，在低氧刺激去除后也仍然可以維持肺血管重塑，并顯示存在抗凋亡內(nèi)皮細

4、胞增殖。因而，SuHx誘導(dǎo)PH模型，可基本模擬人類PH的主要病理生理特點，被認為優(yōu)于CHPH大鼠模型。
　　水通道蛋白1（AQP1）屬于膜蛋白家族一員，主要轉(zhuǎn)運水分子和無電荷的小分子，在多種細胞上如上皮細胞、黑色素瘤細胞以及平滑肌細胞均有表達。除了轉(zhuǎn)運水分子外，目前水通道蛋白多被認為與細胞的遷移功能相關(guān)。我們在CHPH的前期研究中發(fā)現(xiàn)，PASMCs的異常遷移和增殖與AQP1高表達相關(guān)，且受AQP1 C尾的影響，但具體調(diào)控機制尚不清

5、。β-catenin在機體中具有多重功能：1）在細胞和細胞連接處，同時結(jié)合肌動蛋白與細胞骨架相連，起固定細胞的作用；2）β-catenin通過形成降解復(fù)合物被泛素化降解，當降解復(fù)合物被抑制后，胞漿內(nèi)的β-catenin得以穩(wěn)定，可入核作為轉(zhuǎn)錄因子而起作用。β-catenin的直接靶基因cMyc和cyclin D1都在細胞增殖過程中起重要作用。
　　慢性血栓栓塞性肺動脈高壓（ CTEPH）是一種以一次或反復(fù)多次發(fā)生的肺栓塞造成肺血管

6、床慢性阻塞、肺血流阻力增加和肺動脈壓力升高為臨床特點的綜合征。其發(fā)病隱蔽，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，容易誤診漏診，部分患者可通過肺動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)得到治愈。然而部分位于肺遠端小動脈的堵塞、伴或不伴肺血管病變和部分患者術(shù)后肺動脈壓力的持續(xù)升高都是手術(shù)治療不可忽略的局限性。因而進一步探索CTEPH的病理生理學(xué)機制十分必要。本課題分為兩部分，分別在不同的模型中探討肺動脈高壓發(fā)病的分子機制。
　　【目的】
　　第一部分通過探究AQP1在Su

7、Hx誘導(dǎo)肺動脈高壓動物模型中的表達，明確AQP1在PH發(fā)病機制中的重要性；進一步研究AQP1對PASMCs遷移和增殖的影響，探討 AQP1對β-catenin及其靶基因的調(diào)控作用；闡明β-catenin在慢性低氧所致PASMCs遷移和增殖中的作用。
　　第二部分通過左肺動脈結(jié)扎法建立 CTEPH模型，闡述肺動脈平滑肌內(nèi)鈣離子濃度和SOCE的改變以及TRPC1、TRPC6和Kv1.5和Kv2.1的變化，探討慢性血栓栓塞性肺動脈高壓中

8、肺動脈平滑肌細胞異常增殖的分子機制。
　　【方法】
　?。?）通過SuHx誘導(dǎo)建立大鼠肺動脈高壓模型；（2）左肺動脈結(jié)扎法建立大鼠CTEPH模型；（3）培養(yǎng)大鼠原代遠端肺動脈平滑肌細胞；（4）構(gòu)建GFP、野生型AQP1、C尾缺失AQP1的腺病毒載體（5）利用InCyte細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)，檢測大鼠PASMCs基礎(chǔ)[Ca2+]i和SOCE；（4）應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）和免疫印跡Western blottin

9、g檢測PASMCs和肺動脈平滑肌特異基因和蛋白的表達；（5）siRNA轉(zhuǎn)染基因敲除實驗；（6）細胞跨孔法檢測細胞遷移；（7）BrdU法檢測細胞增殖。
　　【結(jié)果】
　　第一部分
　　1）SuHx肺動脈高壓模型，肺動脈平滑肌組織中AQP1蛋白表達上調(diào)。
　　2）Lin-7蛋白在肺動脈平滑肌細胞中無表達。
　　3）在PASMCs中，過表達野生型AQP1可上調(diào)β-cantenin、cMyc和cyclin D1的表

10、達，而過表達缺失C尾的AQP1卻對上述基因沒有影響。
　　4）利用小干擾RNA降低β-catenin的表達可抑制AQP1介導(dǎo)的PASMCs遷移和增殖。
　　5）低氧上調(diào)β-catenin在PASMCs中的表達。
　　6）降低β-catenin在PASMCs的表達可以阻斷低氧誘導(dǎo)的細胞遷移和增殖。
　　第二部分
　　1） LPAL法可建立CTEPH大鼠模型，模型組大鼠RVSP、RVH和D二聚體均明顯升高，且出

11、現(xiàn)肺血管重塑。
　　2） LPAL造模2周和5周后，PASMCs內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子水平及SOCE呈進行性升高。
　　3） LPAL造模后，大鼠肺動脈平滑肌組織TRPC1和TRPC6表達上調(diào)，而Kv1.5和Kv2.1 mRNA水平受抑制。
　　【結(jié)論】
　　1、低氧促進β-catenin的表達，β-catenin對PASMCs的增殖和遷移具有重要作用；AQP1通過β-catenin調(diào)控PASMCs的遷移和增殖，并上調(diào)cM