植物維生素E生物合成途徑及調(diào)控.pdf

1、作為一種重要的脂溶性抗氧化物質(zhì),維生素E(生育酚)在人類和動(dòng)物的日常膳食中起著不可或缺的作用。維生素E只能在光合自養(yǎng)植物中合成,人類的日常所需攝取白植物源性的食物或藥物補(bǔ)充。近來(lái),借助于基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),維生素E生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因已在模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)和藍(lán)藻(Synechocystis sp.PCC 6803)中得以確認(rèn)并克隆,由此廓清了植物維生物E生物合成途徑的結(jié)構(gòu)。
　　本

2、文以高等植物擬南芥維生素E生物合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因?yàn)榛A(chǔ),通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法對(duì)該途徑進(jìn)行遺傳操作,圍繞維生素E生物合成途徑進(jìn)行了兩個(gè)方向、四個(gè)具體內(nèi)容的研究。
　　一個(gè)方向是以模式生物擬南芥為平臺(tái),著力于評(píng)價(jià)生物合成途徑各位點(diǎn)關(guān)鍵酶基因?qū)S生素E合成產(chǎn)生的影響,為提升作物維生素E總量或改變作物維生素E組成提供有效的策略,并在蔬菜作物生菜中進(jìn)行初步的驗(yàn)證,成功獲得了大幅度提升維生素E含量和組成的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的作物品系;另一方向由關(guān)鍵酶和

3、代謝途徑作為切入點(diǎn),研究維生素E在植物生理中的作用,觀察分析了維生素E與維生素C之間的關(guān)系,并且探討了維生素E對(duì)植物逆境防御的影響。
　　四個(gè)具體研究?jī)?nèi)容概述如下:
　　1)擬南芥遺傳背景下維生素E生物合成途徑關(guān)鍵酶作用評(píng)價(jià)
　　以模式生物擬南芥為平臺(tái),在同一遺傳背景下單獨(dú)轉(zhuǎn)化維生素E生物合成途徑五個(gè)關(guān)鍵酶基因(hppd、hpt、mpbq mt、tc和y-tmt),通過(guò)分析過(guò)量表達(dá)株系維生素E的含量和組成,對(duì)各個(gè)關(guān)鍵酶

4、在維生素E生物合成途徑中的作用加以評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化維生素E生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)該基因的表達(dá)水平,同時(shí)促進(jìn)維生素E含量的提高和/或組成的改變。依據(jù)主要作用的不同,五個(gè)關(guān)鍵酶大致可以分為兩類——以提高維生素E含量為主要作用(包括HPPD和HPT)和以改變維生素E組成為主要作用(包括MPBQ MT、TC和r-TMT)。在單基因轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)選擇并設(shè)計(jì)了雙基因轉(zhuǎn)化策略,分別是組合y-tmt+hpt和y-tmt+mpbq

5、 mt,進(jìn)一步驗(yàn)證了單基因轉(zhuǎn)化評(píng)價(jià)的結(jié)論,并發(fā)現(xiàn)了雙基因轉(zhuǎn)化對(duì)同時(shí)提高維生素E的含量和改變維生素E組成有著十分顯著的作用?；诖搜芯?以擬南芥為平臺(tái),建立了一整套可供評(píng)價(jià)比較的體系,為日后農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)作物的轉(zhuǎn)基因工作提供有效的策略。
　　2)通過(guò)基因工程方法調(diào)控生菜維生素E生物合成途徑
　　基于在擬南芥中的研究,選擇擬南芥維生素E生物合成途徑關(guān)鍵酶HPT和Y-TMT的基因,分別構(gòu)建單基因轉(zhuǎn)化和雙基因共轉(zhuǎn)化載體,組成性表達(dá)于生菜

6、(Lactuca sativa L.var.1ogifolia)中,并獲得含有目的基因的轉(zhuǎn)基因株系。結(jié)果表明,單獨(dú)轉(zhuǎn)化hpt基因的株系可以提高維生素E生物合成途徑的產(chǎn)物量,單獨(dú)轉(zhuǎn)化y-tmt的株系可以改變維生素E的組成,使其中啊a-生育酚的比例大幅提高,雙基因共轉(zhuǎn)化株系較之非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?NC)和單基因轉(zhuǎn)化株系,大幅度的提高了葉片維生素E的含量,最高達(dá)到了64.55μg/g FW,是NC株系葉片維生素E含量的9倍多,是hpt單基因轉(zhuǎn)化最高

7、表達(dá)株系的3倍多。由此得出結(jié)論,雙基因共轉(zhuǎn)化株系可以兼具提高維生素E總量以及改變組成的功能。另外值得注意的是提高下游關(guān)鍵酶y-TMT的表達(dá)可以正向拉動(dòng)生物合成,促進(jìn)反應(yīng)向下游進(jìn)行,若同時(shí)提升上游關(guān)鍵酶的表達(dá),可以明顯提高最終產(chǎn)物量。本實(shí)驗(yàn)為改良蔬菜作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)提供了一個(gè)有效的方法。
　　3)基因工程調(diào)控維生素E生物合成途徑對(duì)植物內(nèi)源維生素C含量的影響
　　以網(wǎng)絡(luò)的角度,維生素E含量的提升可能會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系中抗壞血酸(維生素C

8、)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)過(guò)量單一表達(dá)維生素E生物合成途徑關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)基因株系葉片加以對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源維生素C的總量與維生素E的含量以及a-/y-生育酚比例有負(fù)相關(guān)性。進(jìn)一步的分析揭示在轉(zhuǎn)基因株系中,參與Halliwell-Asada循環(huán)的關(guān)鍵酶基因(如apx、dhar和mdar)出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào),但維生素C生物合成途徑相關(guān)基因并沒(méi)有出現(xiàn)顯著變化。這些發(fā)現(xiàn)初步揭示了脂溶性抗氧化物質(zhì)維生素E與水溶性抗氧化物質(zhì)維生素C之間通過(guò)Halliwell-A

9、sada循環(huán)相互聯(lián)系相互影響的關(guān)系,這對(duì)植物體內(nèi)氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持及植物生理活動(dòng)有著重要的影響。本研究有助于進(jìn)一步了解維生素E在植物生理中的作用,亦有助于為代謝工程提供實(shí)踐的指導(dǎo)。
　　4)改變擬南芥生育酚環(huán)化酶(TC)表達(dá)水平對(duì)維生素E生物合成的影響及其在逆境中的生理功能
　　為研究維生素E在植物生理過(guò)程中的作用,通過(guò)基因工程方法調(diào)控關(guān)鍵酶TC的表達(dá)水平,構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)tc和RNAi抑制表達(dá)tc的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系,觀察測(cè)

10、量了這兩種株系及NC株系在正常生理狀態(tài)和逆境生理狀態(tài)(鹽逆境、干旱逆境)下的多種生理指標(biāo)。結(jié)果表明,過(guò)量表達(dá)tc導(dǎo)致葉片Y-生育酚含量的顯著提高,a-生育酚幾乎不受影響;RNAi抑制tc的表達(dá)導(dǎo)致葉片生育酚含量的缺失,在正常生理狀態(tài)下,雖不會(huì)致死,但植株出現(xiàn)了明顯的生長(zhǎng)延緩和矮弱現(xiàn)象,并導(dǎo)致維生素C含量的代償性提高。施以不同程度逆境刺激后,與NC株系相比較,過(guò)量表達(dá)tc的株系的抗逆能力稍有增強(qiáng)。但是RNAi抑制tc表達(dá)的株系則出現(xiàn)了對(duì)逆