循環(huán)microRNA及血清TK1在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的價值的研究.pdf

1、論文Ⅰ循環(huán)microRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及診斷價值
　　研究背景：
　　在近幾十年里，甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生率有著明顯的增加，主要?dú)w功于甲狀腺超聲檢查應(yīng)用的廣泛普及。但是甲狀腺良性結(jié)節(jié)占甲狀腺結(jié)節(jié)的絕大部分，僅有極少數(shù)為惡性結(jié)節(jié)，需要行手術(shù)治療。甲狀腺惡性腫瘤中最常見的是甲狀腺乳頭狀癌(PTC)。故而，甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺良性結(jié)節(jié)的鑒別是非常重要的，可以避免不必要的手術(shù)治療。目前，甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(FNAC)是

2、鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，仍然有一小部分甲狀腺結(jié)節(jié)因為各種原因不能通過FNAC明確病理診斷，可能會導(dǎo)致相對盲目的治療和不必要的甲狀腺手術(shù)。因此，提高鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的準(zhǔn)確性是急需解決的問題。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類長約22nt的單鏈、非蛋白編碼RNA，其廣泛存在于真核細(xì)胞中，對基因具有調(diào)控功能。MicroRNA參與大多數(shù)的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞的生長、分化、凋亡和粘附。越來越多的研究表明，miRNA在多種

3、惡性腫瘤中表達(dá)異常，包括甲狀腺乳頭狀癌。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的miRNA可以釋放入循環(huán)中，并可以逃避降解被穩(wěn)定獲得。很多的研究已經(jīng)顯示出循環(huán)miRNA作為非侵入性的生物分子標(biāo)志物在腫瘤診斷以及術(shù)后監(jiān)測中的價值。然而，到目前為止，關(guān)于循環(huán)miRNA在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)情況的研究還很少，而且研究結(jié)果的一致性也較差。
　　基于以上兩點(diǎn)，我們考慮需要進(jìn)行更多的研究來闡明甲狀腺乳頭狀癌病人循環(huán)中miRNA的表達(dá)情況，并探討其作為一種無創(chuàng)性的生物分子

4、標(biāo)志物在甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前鑒別診斷及乳頭狀癌術(shù)后監(jiān)測中的價值。
　　研究目的：
　　1、明確甲狀腺乳頭狀癌患者血液循環(huán)中miRNA的表達(dá)情況;
　　2、篩選出可用于協(xié)助鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的循環(huán)miRNA指標(biāo);
　　3、評估篩選出的循環(huán)miRNA在監(jiān)測甲狀腺乳頭狀癌復(fù)發(fā)方面的作用。
　　研究方法：
　　1、研究對象為在煙臺毓璜頂醫(yī)院甲狀腺外科行甲狀腺手術(shù)治療的甲狀腺結(jié)節(jié)病人，按照術(shù)后病理結(jié)果分為甲狀腺乳

5、頭狀癌組和甲狀腺良性結(jié)節(jié)組(各組n=50)。正常對照組為在煙臺毓璜頂醫(yī)院查體中心選取的無甲狀腺結(jié)節(jié)及甲狀腺相關(guān)疾病的正常人(n=50)。
　　2、標(biāo)本采集:
　?、偎袇⑴c者的血漿樣本;
　?、诮M織標(biāo)本包括:部分PTC病人的癌組織樣本、癌旁正常甲狀腺組織樣本及良性結(jié)節(jié)病人的甲狀腺良性結(jié)節(jié)組織樣本（各組n=27）。
　　③部分PTC病人術(shù)后4周的血漿樣本(n=24)。
　　3、提取血漿樣本和組織樣本的總RNA

6、。
　　4、對PTC組、甲狀腺良性結(jié)節(jié)組及正常對照組血漿樣本（每組n=3）中的miRNA表達(dá)譜采用miRNA芯片技術(shù)進(jìn)行分析，并篩選出PTC循環(huán)血中異常表達(dá)的miRNA。
　　5、對篩選出的異常表達(dá)的miRNA應(yīng)用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)在PTC組、良性結(jié)節(jié)組以及正常對照組血漿樣本中進(jìn)行進(jìn)一步驗證(每組n=50)，并評估這些指標(biāo)在甲狀腺結(jié)節(jié)中的診斷價值。
　　6、分析PTC臨床病理特征（性別、年齡、腫瘤

7、大小、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、瘤體外浸潤，腫瘤多灶性、腫瘤單側(cè)或雙側(cè)、腫瘤分期及BRAF基因突變情況）與經(jīng)上述驗證在PTC循環(huán)中異常表達(dá)的miRNA的相關(guān)性。
　　7、對于經(jīng)過驗證在PTC循環(huán)中異常表達(dá)的miRNA，通過qRT-PCR檢測癌組織及癌旁正常甲狀腺組織、良性結(jié)節(jié)組織中上述miRNA的水平（每組n=27），評估這些miRNA在組織中的表達(dá)與在血漿中的表達(dá)是否一致。
　　8、隨訪行甲狀腺癌全切術(shù)后的患者(n=24)，通過q

8、RT-PCR檢測患者術(shù)后4周血漿中經(jīng)上述驗證在PTC循環(huán)血中表達(dá)明顯上調(diào)的miRNA的水平，與患者術(shù)前血漿中miRNA水平進(jìn)行比較，評估這些miRNA對判斷PTC復(fù)發(fā)的價值。
　　研究結(jié)果：
　　1、應(yīng)用microRNA芯片技術(shù)篩選出的在甲狀腺乳頭狀癌組異常表達(dá)的miRNA應(yīng)用miRCURYTM LNA Array(Exiqon)芯片檢測PTC組、良性結(jié)節(jié)組及正常對照組中血循環(huán)中miRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，957個miR

9、NA在三組樣本中均有表達(dá)。對這些miRNA進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與正常對照組和良性結(jié)節(jié)組相比，miR-124-3p，miR-9-3p，miR-5691在PTC組中表達(dá)均顯著增高，而miR-4701-3p，miR-196b-5p表達(dá)則顯著降低(P＜0.05)。
　　2、經(jīng)qRT-PCR驗證的在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)異常的miRNA
　　對各組標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR檢測進(jìn)一步驗證上述miRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， PTC組中m

10、iR-124-3p和miR-9-3p表達(dá)顯著高于正常對照組和良性結(jié)節(jié)組(P＜0.05)，該兩項指標(biāo)在良性結(jié)節(jié)組和正常對照組中表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異。miRNA-5691雖然在PTC組樣本中呈表達(dá)上調(diào)，但是其在血漿中含量非常低，會導(dǎo)致較差的特異性和敏感性，故未進(jìn)行驗證。miR-4701-3p在三組中的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異;miR-196b-5p在良性結(jié)節(jié)組中的表達(dá)水平明顯高于其他兩組(P＜0.05)，而在PTC組和正常對照組間表達(dá)水平無統(tǒng)計

11、學(xué)差異。
　　3、循環(huán)miRNA對甲狀腺結(jié)節(jié)的鑒別診斷價值
　　應(yīng)用ROC分析了miR-124-3p，miR-9-3p和miR-196b-5p的診斷價值，
　?、傥覀儽容^了miR-124-3p在PTC組與良性結(jié)節(jié)組中的表達(dá)，顯示出ROC曲線下面積為0.831[其95％可信區(qū)間為0.747-0.915]，以2.04為截斷點(diǎn)時顯示出88％的敏感性和76％的特異性。
　?、趍iR-9-3p在PTC組與良性結(jié)節(jié)組中的表達(dá)

12、，顯示出ROC曲線下面積為0.753[其95％可信區(qū)間為0.657-0.849]，以2.09為截斷點(diǎn)時顯示出70％的敏感性和64％的特異性。
　?、墼诹夹越Y(jié)節(jié)患者與PTC患者的分析比較中，miR-196b-5p顯示出ROC曲線下面積為0.781[其95％可信區(qū)間為0.690-0.872]，以1.545為截斷點(diǎn)時顯示出74％的敏感性和66％的特異性。
　　4、循環(huán)miRNA的表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系
　　根據(jù)年齡、性

13、別、腫瘤相關(guān)病理特點(diǎn)和BRAF基因突變對研究對象進(jìn)行亞組分組，進(jìn)一步分析miR-124-3p，miR-9-3p和miR-196b-5p在不同亞組中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-124-3p在年輕患者（年齡小于45歲）和腫瘤直徑大于2cm的患者中呈高表達(dá)。miR-9-3p在年輕患者中也表現(xiàn)出明顯的表達(dá)增高。miR-196b-5p與腫瘤臨床病理特點(diǎn)無相關(guān)性。
　　5、miR-124-3p，miR-9-3p和miR-196b-5p在甲狀

14、腺組織中的表達(dá)
　　為觀察甲狀腺組織中miRNAs表達(dá)水平是否與循環(huán)miRNA表達(dá)變化一致，進(jìn)一步分析了PTC組織、癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺良性結(jié)節(jié)組織中miR-124-3p，miR-9-3p和miR-196b-5p的表達(dá)水平。檢測結(jié)果表明:與甲狀腺良性結(jié)節(jié)組織及正常甲狀腺組織相比，miR-124-3p和miR-9-3p在PTC組織中的表達(dá)水平明顯增高。miR-196b-5p在良性甲狀腺結(jié)節(jié)組織中的表達(dá)水平呈明顯升高。結(jié)果與在血

15、漿中的表達(dá)情況一致。
　　6、miR-124-3p和miR-9-3p在甲狀腺癌術(shù)后表達(dá)情況
　　為評估PTC中表達(dá)異常增高的miR-124-3p和miR-9-3p在監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)中的價值，進(jìn)一步檢測了PTC患者甲狀腺全切除術(shù)后4周的循環(huán)miR-124-3p和miR-9-3p表達(dá)水平。結(jié)果顯示:循環(huán)miR-124-3p和miR-9-3p在術(shù)后4周均較術(shù)前明顯下降，分別下降為術(shù)前水平的36％和24％(P＜0.05)。
　　結(jié)

16、論：
　　1、循環(huán)中miR-124-3p和miR-9-3p表達(dá)水平在甲狀腺乳頭狀癌患者中增高，與腫瘤組織中表達(dá)水平呈一致性變化，在鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性中有較高的診斷價值;
　　2、循環(huán)miR-196b-5p在甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者中的表達(dá)水平明顯高于甲狀腺乳頭狀癌和正常對照者，在鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性中也有較好的診斷價值;
　　3、miR-124-3p和miR-9-3p或許可以作為甲狀腺乳頭狀癌患者甲狀腺全切術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的

17、監(jiān)測指標(biāo)
　　關(guān)鍵詞:甲狀腺乳頭狀癌;循環(huán)miRNA; miR-124-3p; miR-9-3p; miR-196b-5p
　　論文Ⅱ血清TK1在中國東部沿海地區(qū)甲狀腺乳頭狀癌診斷以及術(shù)后監(jiān)測中的潛在作用
　　研究背景：
　　癌癥已經(jīng)成為現(xiàn)代人類生活中的主要疾病之一，也是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病。調(diào)查顯示癌癥的發(fā)生率在逐年上升。甲狀腺惡性腫瘤中最常見的是甲狀腺乳頭狀癌(PTC)，近年P(guān)TC的發(fā)生率也在顯著升高。因此

18、，早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷甲狀腺乳頭狀癌是非常重要的，可以避免治療的延誤以及不必要的甲狀腺切除手術(shù)。隨著甲狀腺超聲及甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(FNAC)的廣泛應(yīng)用，甲狀腺乳頭狀癌的診斷準(zhǔn)確率明顯升高，但仍有一小部分甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺良性結(jié)節(jié)難以區(qū)分，以至于被漏診或誤診。因此，近年來很多的研究者專注于與甲狀腺乳頭狀癌相關(guān)的分子生物標(biāo)志物的研究，期待通過這些生物標(biāo)志物的輔助來早期發(fā)現(xiàn)、診斷及監(jiān)測甲狀腺乳頭狀癌。
　　胸苷激酶1(TK1)

19、存在于細(xì)胞質(zhì)中，是嘧啶代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。TK1與細(xì)胞異常增殖有關(guān)，很多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血清TK1在健康人群中可以作為惡性腫瘤風(fēng)險篩查的一種穩(wěn)定的生物標(biāo)志物。也有很多的研究證實血清TK1在多種類型惡性腫瘤中的水平呈明顯升高。然而，到目前為止，僅有兩項關(guān)于血清TK1與甲狀腺惡性腫瘤的研究，均顯示與正常人相比血清TK1在甲狀腺癌中的水平明顯升高，但這兩項研究均沒有闡明血清TK1在甲狀腺良性結(jié)節(jié)中的水平。
　　基于以上兩點(diǎn)，我們考慮需

20、要進(jìn)行更多的研究來探討血清TK1作為一種無創(chuàng)性的生物標(biāo)志物在甲狀腺乳頭狀癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及術(shù)后監(jiān)測中的價值。
　　研究目的：
　　1、檢測甲狀腺乳頭狀癌病人及甲狀腺良性結(jié)節(jié)病人血清TK1的水平
　　2、評估血清TK1在甲狀腺乳頭狀癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及術(shù)后監(jiān)測中的價值。
　　研究方法：
　　1、研究對象為在煙臺毓璜頂醫(yī)院甲狀腺外科行甲狀腺手術(shù)治療的甲狀腺結(jié)節(jié)病人，按照術(shù)后病理結(jié)果分為甲狀腺乳頭狀癌組(n

21、=385)和良性結(jié)節(jié)組(n=384)。正常對照組為在煙臺毓璜項醫(yī)院查體中心選取的無甲狀腺結(jié)節(jié)及甲狀腺相關(guān)疾病的正常人(n=100)。
　　2、標(biāo)本采集:
　　①所有參與者的血清樣本
　?、诓糠旨谞钕偃轭^狀癌病人(n=123)術(shù)后4周的血清樣本
　　③部分PTC病人的癌組織樣本(n=300)
　　3、應(yīng)用酶免疫點(diǎn)印跡化學(xué)發(fā)光法檢測甲狀腺乳頭狀癌組、良性結(jié)節(jié)組及正常對照組血清樣本中的人細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶1濃度，分析

22、血清TK1在三組中的濃度差異。并評估血清TK1在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的價值
　　4、應(yīng)用qRT-PCR檢測甲狀腺癌組織(n=300)中的BRAFV600E基因突變情況。
　　5、分析甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征（年齡、性別、腫瘤的大小、是否有瘤體外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤多灶性、腫瘤單側(cè)或雙側(cè)、腫瘤分期及BRAF基因突變情況）與血清TK1的相關(guān)性。
　　6、分析甲狀腺乳頭狀癌病理類型與血清TK1的相關(guān)性。
　　7、

23、隨訪行甲狀腺癌切除術(shù)后的患者(n=123)，檢測患者術(shù)后4周血清TK1的水平，與患者術(shù)前血清TK1水平進(jìn)行比較，評估血清TK1對判斷甲狀腺乳頭狀癌復(fù)發(fā)的價值。
　　研究結(jié)果：
　　1、三組入選者臨床特點(diǎn)
　　甲狀腺乳頭狀癌組病人血清TSH水平高于良性結(jié)節(jié)組病人，而血清FT3水平低于良性結(jié)節(jié)組病人但高于正常對照者。三組入選者其他臨床特點(diǎn)無明顯差異。
　　2、甲狀腺乳頭狀癌組、良性結(jié)節(jié)組及正常對照組中血清TK1的水平

24、
　　經(jīng)檢測，血清TK1濃度在甲狀腺乳頭狀癌組中明顯高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)組和正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。而且，甲狀腺良性結(jié)節(jié)組中的血清TK1濃度也明顯高于正常對照組。
　　3、血清TK1對甲狀腺乳頭狀癌的診斷價值
　　應(yīng)用ROC分析了血清TK1的診斷價值，血清TK1在甲狀腺乳頭狀癌病人與正常對照者的鑒別診斷中表現(xiàn)出高度敏感性和特異性，而且在鑒別甲狀腺良性結(jié)節(jié)病人與正常對照者中也表現(xiàn)出較好的敏感性和特異性。但無法鑒別甲

25、狀腺乳頭狀癌與甲狀腺良性結(jié)節(jié)病人。
　　4、血清TK1的水平與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系
　　分析了不同亞組中血清TK1的濃度，這些亞組是根據(jù)年齡、性別、腫瘤相關(guān)病理特點(diǎn)和BRAF基因突變進(jìn)行的分組。血清TK1濃度在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC亞組中呈明顯增高。
　　5、血清TK1水平與甲狀腺乳頭狀癌的病理類型之間的關(guān)系
　　分析了不同病理類型甲狀腺乳頭狀癌病人血清TK1的濃度，發(fā)現(xiàn)其無明顯差異。
　　6

26、、甲狀腺乳頭狀癌病人術(shù)后血清TK1濃度變化
　　檢測了甲狀腺乳頭狀癌病人術(shù)后4周血清TK1的水平，結(jié)果呈明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1、甲狀腺乳頭狀癌病人血清TK1濃度明顯高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)病人和正常對照者。且甲狀腺術(shù)后，血清TK1水平明顯下降。
　　2、血清TK1濃度在甲狀腺乳頭狀癌與正常對照者的鑒別中有較高的診斷價值，敏感性和特異性均較高。但無法鑒別甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)。
　　3、血清TK1或許可以作為中國