SIRT3與非酒精性脂肪性肝病的關(guān)聯(lián)及功能研究.pdf

1、近年來(lái)非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的全球發(fā)病率逐年上升，且有患者逐漸年輕化的趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，目前全世界約20％～30％的成年人可能患有NAFLD，其中大部分處于SFL階段，且早期不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的癥狀或肝功能損害，因此并未得到足夠的重視。而SFL患者中又有約1/5的人可能會(huì)在數(shù)年內(nèi)進(jìn)展成為NASH患者甚至肝硬化和肝癌。因此，NAFLD已成為一種對(duì)大眾健康造成嚴(yán)重身心危害的

2、常見(jiàn)病和多發(fā)病，各國(guó)政府和全社會(huì)對(duì)于該病的科研性和診治性投入也不斷增多。但目前尚無(wú)防治NAFLD的有效措施，這有賴于對(duì)該病發(fā)生機(jī)制的深入探索。
　　既往研究提示SIRT3分子是肝臟脂肪代謝調(diào)控的重要分子，能夠通過(guò)對(duì)一系列的底物去乙?；揎椃磻?yīng)來(lái)參與調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞的脂肪酸氧化、氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)、線粒體功能改變以及炎癥因子表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程，這些過(guò)程均可能與NAFLD的發(fā)病及進(jìn)展關(guān)系密切。本課題組長(zhǎng)期從事糖尿病、脂肪肝等慢性代謝性疾病的營(yíng)養(yǎng)干

3、預(yù)方案研究，發(fā)現(xiàn)SIRT3是運(yùn)動(dòng)、卡路里限制和植物化合物等營(yíng)養(yǎng)、運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案的核心分子。為了找到SIRT3基因是否在人群脂肪肝發(fā)生的證據(jù)，我們選取SIRT3作為目的靶標(biāo)基因，首先利用生物信息學(xué)方法分析SIRT3基因的連鎖不平衡關(guān)系和基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn);然后建立NAFLD的人群研究隊(duì)列，納入384名NAFLD患者和384名正常對(duì)照者，分別提取其基因組DNA，并對(duì)S

4、IRT3基因的13個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型和關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了SNP位點(diǎn)rs11246020，rs3782118和rs73392700與疾病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步研究SIRT3功能獲得(gain-of-function)如何影響NAFLD的疾病過(guò)程，我們利用長(zhǎng)程高脂喂養(yǎng)方法成功構(gòu)建NAFLD小鼠模型，構(gòu)建了SIRT3真核表達(dá)質(zhì)粒載體，采用轉(zhuǎn)染試劑包裝后用間斷性尾靜脈注射的方法成功誘導(dǎo)模型小鼠肝臟發(fā)生SIRT3基因的高表達(dá)，監(jiān)測(cè)并分析動(dòng)物膳

5、食攝入和體重增長(zhǎng)的關(guān)系，并采用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)小鼠肝臟和血液中脂質(zhì)代謝相關(guān)的甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇(total cholesterol，CHO)和游離脂肪酸(free fat acid，F(xiàn)FA)等生化指標(biāo)，同時(shí)采用肝臟HE染色、油紅O染色觀察肝細(xì)胞脂肪聚積等病理學(xué)變化，并提取蛋白和RNA，分別采用蛋白印跡和Real-time PCR等方法檢測(cè)相關(guān)蛋白和脂肪酸代謝相關(guān)信號(hào)通路中Pparα、cpt1a、cpt1

6、b和Acox1等基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)SIRT3基因編碼區(qū)SNP rs11246020的基因型分布在NAFLD和對(duì)照人群中分布有顯著差異，GG基因型個(gè)體相對(duì)AG+AA基因型個(gè)體有風(fēng)險(xiǎn)增加的效應(yīng)(OR=1.4，P=0.0427)。rs3782118和rs73392700不同等位基因型(allele)與NAFLD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（ORT/C-rs3782118=1.27,P=0.0361;ORC/G-rs7339

7、2700=1.45,P=0.0361）。
　　(2)長(zhǎng)程高脂膳食喂養(yǎng)可成功構(gòu)建小鼠NAFLD模型，采用SIRT3基因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染方法可成功將人源性的SIRT3基因轉(zhuǎn)至模型小鼠肝臟內(nèi)，并導(dǎo)致SIRT3蛋白在肝內(nèi)的高表達(dá);處理25天后SIRT3高表達(dá)組NAFLD模型小鼠的體重顯著低于空載體組小鼠，被有效地控制在較低的水平;而空載體組小鼠的體重則呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，并穩(wěn)定在較高的水平。
　　(3)SIRT3基因治療模型小鼠肝臟組織中

8、的脂肪組織蓄積、細(xì)胞空泡樣變性和脂肪樣變的程度均顯著低于空載體組，肝臟中TG、CHO、FFA的產(chǎn)生以及血清中FFA的水平也顯著低于空載體組。SIRT3基因高表達(dá)后，肝臟中與脂代謝密切相關(guān)的基因Pparα及下游靶基因Acox1的轉(zhuǎn)錄顯著下降。
　　結(jié)論:
　　(1)SIRT3基因多態(tài)性參與影響人群NAFLD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
　　(2)SIRT3的基因獲得效應(yīng)（gain-of-function）對(duì)NAFLD模型小鼠肝臟脂肪積累表