PI3K-mTOR雙重抑制劑對體外培養(yǎng)血管瘤細胞的影響及機制.pdf

1、目的：
　　觀察PI3K/ mTOR雙重抑制劑NVP-BEZ235對體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細胞增殖、凋亡及PI3K/AKt/mTOR信號通路中關(guān)鍵分子的影響，探討PI3K/mTOR雙重抑制劑對體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細胞的作用及機制。
　　方法：
　　1.選取手術(shù)切除的嬰幼兒血管瘤標本，組織塊結(jié)合酶消化法培養(yǎng)原代血管瘤內(nèi)皮細胞，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長特點，繪制生長曲線。細胞傳至第四代后，采用第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原進行鑒定。

2、
　　3.無血清培養(yǎng)基處理血管瘤內(nèi)皮細胞24h后，干預組加入0.50μM、1.00μM NVP-BEZ235，空白對照組加入完全培養(yǎng)基，共同孵育24h。通過CCK-8試劑盒檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期，免疫蛋白質(zhì)印跡方法檢測 PI3K、p-Akt、mTOR及p70s6k蛋白的表達水平，分析血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及凋亡變化與四種蛋白表達水平的相互關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.血管瘤原代培養(yǎng)1周后出現(xiàn)少量貼壁細

3、胞，3周后細胞由組織塊向周圍成同心圓式分布并且生長速度加快，4周后細胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底，顯微鏡下觀察可看到梭形或稍不規(guī)則形態(tài)的細胞，成鋪路石樣排列。第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原鑒呈陽性表達。
　　2. NVP-BEZ235干預24h后，CCK-8細胞增殖檢測顯示，0.50μM、1.00μM NVP-BEZ235組的OD值分別為（0.88±0.03、0.59±0.05），與對照組（1.10±0.02）比較，差異均有顯著性（P<0.01，t=

4、7.05、13.07）；且1.00μM組比0.50μM組對細胞增殖的抑制作用更強，差異具有顯著性（P<0.01，t=9.23）。
　　3.流式細胞術(shù)檢測顯示，0.50μM組G0/G1期細胞比例為(60.62±0.71)％，1.00μM組G0/G1期細胞比例為(65.99±2.55)%，均較對照組(53.71±1.43)%高，差異均有顯著性（P<0.01，t=-7.51、-7.28）；且1.00μM組較0.50μM組更高，差異有有統(tǒng)

5、計學意義（P<0.05，t=-3.51）。
　　4.流式細胞術(shù)檢測顯示，0.50μM組內(nèi)皮細胞總凋亡率為(9.20±0.75)%，1.00μM組內(nèi)皮細胞總凋亡率為（13.13±1.72）%，均較對照組(2.77±1.23)%升高，差異均有顯著性（P<0.01，t=-9.80、-8.93）；且1.00μM組較0.50μM組更高，差異有有統(tǒng)計學意義（P<0.05，t=-3.62）。
　　5.蛋白免疫印跡檢測顯示，0.50μM N

6、VP-BEZ235組 PI3K（0.16±0.03）、p-Akt（0.13±0.01）、mTOR（0.12±0.02）蛋白表達水平較對照組PI3K（0.25±0.01）、p-Akt（0.17±0.01）、mTOR（0.19±0.00）下降，p70s6k（0.18±0.01）蛋白較對照組（0.10±0.02）升高，差異具有顯著性（P<0.01，t=4.71、8.51、6.62、-6.26）；1.00μM NVP-BEZ23組PI3K（0.

7、10±0.01)、p-Akt(0.10±0.01)、mTOR(0.05±0.00)蛋白表達水平較對照組下降，p70s6k（0.31±0.02）蛋白較對照組升高，差異具有顯著性（P<0.01，t=26.68、15.40、38.84、-14.77）；且1.00μM NVP-BEZ235組較0.50μM NVP-BEZ235組，PI3K、p-Akt、mTOR蛋白水平下降更為明顯，p70s6k蛋白蛋白水平上升更為明顯，差異具有顯著性（P0.01