多巴胺D1類受體對對氧磷酶2的調(diào)節(jié)在腎臟細胞氧化應激中的作用.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 多巴胺D1類受體對對氧磷酶2的調(diào)節(jié)在腎臟細胞氧化應激中的作用
　　目的：研究多巴胺D1R和D5R對PON2的調(diào)節(jié)在腎臟細胞氧化應激中的作用。
　　方法：1.以小鼠腎臟切片以及D1R轉(zhuǎn)染HEK-293細胞(HEK-hD1R)及D5R轉(zhuǎn)染HEK-293細胞(HEK-hD5R)以及hRPT細胞為研究對象，采用免疫熒光的方法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察多巴胺D1R與PON2以及D5

2、R與PON2的各自表達情況以及是否存在共定位現(xiàn)象;多巴胺D1類受體激動劑fenoldopam短效刺激(1μM，15 min)后，D1R與PON2，D5R與PON2共定位現(xiàn)象是否發(fā)生改變。
　　2.以HEK-hD1R、HEK-hD5R及hRPT細胞為研究對象，采用蔗糖密度梯度離心法提取細胞膜LRs及non-LRs組分，用免疫印跡法檢測蛋白表達，觀察fenoldopam(1μM，15 min)或膽固醇消耗劑甲基-β-環(huán)糊精(methy

3、l-β-cyclodextrin，βCD)(2％，60 min)對 PON2在細胞膜LRs及non-LRs分布的影響。
　　3.在HEK-hD1R、HEK-hD5R細胞上，用免疫印跡法觀察fenoldopam刺激不同時間（1μM，2-24 h）對PON2蛋白表達的影響，以及用D1類受體阻斷劑SCH23390(1μM，24 h)對PON2變化的影響。定量PCR方法觀察fenoldopam長效刺激（1μM，24 h）對PON2基因轉(zhuǎn)錄

4、的影響。
　　4.用免疫印跡法觀察D5R基因敲除小鼠腎臟皮質(zhì)PON2表達變化;在hRPT細胞上，用D5R-siRNA沉默D5R基因，免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染效果，觀察對PON2、NOX2表達以及ROS生成的影響。
　　5.用PON2-siRNA轉(zhuǎn)染細胞沉默PON2基因，用H2DCFDA熒光法測ROS生成及光澤精發(fā)光法檢測NADPH氧化酶活性，分別觀察PON2在fenoldopam長效刺激(1μM，24 h)調(diào)節(jié)ROS生成及NADP

5、H氧化酶活性中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.為了解D1類受體與PON2的作用是否通過直接的物理連接實現(xiàn)，我們首先進行了共定位檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)D1R、D5R與PON2在小鼠腎臟近端小管刷狀緣上表達豐富，D1R與PON2以及D5R與PON2在小鼠腎臟近端小管刷狀緣存在共定位;在hRPT以及HEK-hD1R、HEK-hD5R細胞上，基礎(chǔ)狀態(tài)下D1R和D5R主要表達于細胞膜和細胞漿內(nèi)，PON2主要表達在細胞漿內(nèi)，D1R與PON2以及D

6、5R與PON2有部分共定位，fenoldopam短效刺激促進D1R和D5R的內(nèi)化，與PON2在細胞漿內(nèi)的共定位增加。
　　2.我們推測D1類受體對PON2的調(diào)節(jié)可能有細胞膜LRs參與。通過蔗糖密度梯度離心法，觀察到在HEK-hD1R細胞上，fenoldopam短效刺激導致LRs及non-LRs內(nèi)PON2蛋白含量均升高;在HEK-hD5R及hRPT細胞上，fenoldopam刺激僅升高non-LRs內(nèi)PON2蛋白含量而對LRs內(nèi)PO

7、N2含量無明顯影響。在這三種細胞上，βCD均能促進PON2從LRs向non-LRs組分內(nèi)轉(zhuǎn)移。這體現(xiàn)了D1R與D5R調(diào)節(jié)PON2的不同作用，可能與D1R與D5R不同的抗氧化機制相關(guān)。
　　3.為檢測PON2在D1受體長效抗氧化應激中的作用，首先觀察長效激動D1類受體對PON2表達的影響。在HEK-hD5R細胞上，fenoldopam刺激可呈現(xiàn)時間依賴性地增加PON2蛋白表達，并且該效應可被D1類受體阻斷劑逆轉(zhuǎn)，而在HEK-hD1R

8、細胞上，fenoldopam刺激對PON2蛋白表達無明顯影響。Fenoldopam長效刺激還可升高HEK-hD5R細胞PON2mRNA表達而對HEK-hD1R細胞無影響。這也證明了D1R與D5R對PON2的差異性調(diào)節(jié)。
　　4.D5R基因敲除小鼠PON2表達下降;在hRPT細胞上，D5R-siRNA轉(zhuǎn)染細胞PON2表達下降、NOX2表達上調(diào);D5R-siRNA轉(zhuǎn)染細胞ROS生成增加，該作用可被apocynin逆轉(zhuǎn)。
　　5.

9、在hRPT細胞上，PON2-siRNA明顯削弱了fenoldopam長效刺激對NADPH氧化酶活性及ROS生成的抑制作用。
　　結(jié)論：D1R和D5R通過對PON2的不同調(diào)控機制，以及在短效、長效作用中的不同作用發(fā)揮對氧化應激的差異性調(diào)節(jié)。其中，在短效作用中，D1R可通過上調(diào)LRs內(nèi)PON2表達參與抗氧化調(diào)節(jié)，而D5R則促使PON2向non-LRs轉(zhuǎn)位，可能通過其他的作用機制參與抑制氧化應激。在長效作用中，D1R對PON2表達無影響

10、，而D5R通過上調(diào)PON2表達發(fā)揮抗氧化作用。本研究闡釋了D1類受體在抗氧化作用中的新機制，以及受體亞型的差異性作用，為藥物治療提供了新的靶點。
　　第二部分 多巴胺D3受體與血管緊張素Ⅱ2型受體的交互作用對腎臟水鈉排泄的影響
　　目的：研究多巴胺D3R與AT2R的交互作用對腎臟水鈉排泄的影響及機制研究。
　　方法：1.采用腎動脈灌注技術(shù)，觀察D3R受體激動劑PD128907和AT2R受體激動劑CGP42112A單獨灌

11、注及共同灌注對Wistar大鼠腎臟水鈉排泄的影響，并在D3R受體阻斷劑U99194A或AT2R受體阻斷劑PD123319聯(lián)合灌注時，觀察PD128907及CGP42112A單獨及共同灌注利尿排鈉作用的變化。
　　2.用哇巴因法檢測PD128907和CGP42112A單獨刺激或共同刺激WKY RPT細胞對Na+-K+-ATP酶活性的影響，并在U99194A或PD123319聯(lián)合刺激時，檢測PD128907及CGP42112A分別及聯(lián)

12、合刺激對Na+-K+-ATP酶活性影響的變化。
　　3.采用免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察Wiser大鼠腎臟以及WKYRPT細胞上D3R與AT2R的各自表達情況，以及是否存在共定位，PD128907、CGP42112A單獨或共同刺激后，共定位是否發(fā)生改變。
　　4.探索WKY RPT細胞上D3R與AT2R相互作用的機制。
　　結(jié)果：1.為觀察激活腎臟D3R與AT2R是否在大鼠體內(nèi)交互作用而產(chǎn)生利尿排鈉效應，我們

13、首先通過腎灌注PD128907及CGP42112A，觀察尿量及尿鈉排泄變化。結(jié)果顯示在Wistar大鼠上分別灌注PD128907與CGP42112A可產(chǎn)生促進水鈉排泄的作用，并且分別被D3R或AT2R阻斷劑所阻斷。兩藥共同灌注可產(chǎn)生協(xié)同增強的排鈉利尿作用，該作用可被D3R或AT2R受體阻斷劑逆轉(zhuǎn)。證明了共刺激D3R或AT2R可引起協(xié)同放大的促水鈉排泄作用，并且與D3R或AT2R特異性相關(guān)。
　　2.為檢測D3R與AT2R在離體細胞

14、實驗中是否也存在交互作用而促進鈉排泄，我們通過哇巴因法測定PD128907與CGP42112A對WKY RPT細胞Na+-K+-ATP酶活性的影響。結(jié)果顯示PD128907與CGP42112A分別刺激WKY RPT細胞均可抑制Na+-K+-ATP酶活性，并呈現(xiàn)時間依賴性，該效應可分別被D3R或AT2R阻斷劑逆轉(zhuǎn)。PD128907與CGP42112A共同刺激時產(chǎn)生協(xié)同增強的抑制效應，D3R或AT2R阻斷劑可阻斷該效應。證明共刺激D3R或A

15、T2R可以協(xié)同抑制Na+-K+-ATP酶活性，并且與D3R或AT2R受體特異性相關(guān)。
　　3.因為D3R與AT2R信號傳導均與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinases，MAPK)和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)相關(guān)，因此我們在機制研究中，觀察了PD128907與CGP42112A共作用對磷酸化ERK的影響。結(jié)果顯示

16、共刺激D3R和AT2R時，磷酸化ERK表達協(xié)同增強，MAPK-ERK信號通路可能參與了D3R和AT2R的協(xié)同效應。再用MAPK抑制劑PD98059聯(lián)合用藥，觀察對D3R和AT2R協(xié)同效應有無阻斷作用。結(jié)果顯示PD98059可逆轉(zhuǎn)PD128907與CGP42112A共刺激對D3R和AT2R共定位及共連接的增強作用，并阻斷了對Na+-K+-ATP酶活性的協(xié)同抑制效應。證明MAPK-ERK信號通路參與了D3R和AT2R協(xié)同效應。
　　結(jié)

17、論：我們的研究表明，D3R與AT2R存在交互作用，共刺激時通過促進D3R或AT2R的正向交互作用、對Na+-K+-ATP酶活性的協(xié)同抑制，產(chǎn)生協(xié)同放大的利尿排鈉效應，該效應與MAPK-ERK信號通路相關(guān)。本研究證明了多巴胺受體與血管緊張素Ⅱ受體的交互作用也可產(chǎn)生協(xié)同效應，這種同向的調(diào)節(jié)活動與受體間交互作用的增強以及協(xié)同激活共同信號通路相關(guān)。說明外周多巴胺系統(tǒng)與RAS之間除了相互拮抗發(fā)揮調(diào)節(jié)作用外，還可通過互相促進、協(xié)同增強的方式同向參與