H2S通過抑制p38 MAPK-壞死性凋亡通路保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對抗高血糖引起的損傷及炎癥.pdf

1、研究背景:
　　2016年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球糖尿病報告指出中國的成年人糖尿病患病率接近10％，而糖尿病血管病變是糖尿病最常見的并發(fā)癥，其高致殘率與致死率給國家和患者帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，探索糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制，制定正確的治療策略和尋求有效的治療藥物，成為目前防治糖尿病心血管并發(fā)癥亟需解決的問題。
　　研究目的:
　　(1)探討p38MAPK/壞死性凋亡通路在高糖（high glucose，HG）誘導(dǎo)的人

2、臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷及炎癥中的作用;(2)探討硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是否通過調(diào)控p38MAPK/壞死性凋亡通路保護(hù)HUVECs對抗HG誘導(dǎo)的損傷及炎癥。
　　研究方法:
　　1.細(xì)胞計數(shù)檢測試劑盒-8（CCK-8）檢測HUVECs存活率;
　　2.Western blot法檢測HUVECs中受體相

3、互作用蛋白3（RIP3，為壞死性凋亡的指標(biāo)）、cleaved caspase-3、caspase-9、p38MAPK的表達(dá)水平;
　　3.免疫熒光法檢測p38MAPK的表達(dá)水平;
　　4.雙氯熒光素(DCFH-DA)染色法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;
　　5.羅丹明123(Rh123)染色法檢測細(xì)胞線粒體膜電位(MMP);
　　6.Hoechst33258核染色法熒光顯微鏡照相檢測細(xì)胞凋亡數(shù)量;
　　7

4、.酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測相關(guān)炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)分泌水平;
　　8.小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，敲除RIP3;
　　9.實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)來表示，使用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
　　研究結(jié)果:
　　一、p38MAPK/壞死性凋亡通路介導(dǎo)高血糖誘導(dǎo)人

5、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥
　　1.高濃度葡萄糖（40mmol/l，HG）上調(diào)HUVECs的p-p38MAPK表達(dá);
　　2.HG上調(diào)HUVECs的RIP3表達(dá);
　　3.葡萄糖濃度依賴性降低細(xì)胞存活率;
　　4.壞死性凋亡抑制劑(Nec-1)、RIP3-siRNA及p38MAPK抑制劑減輕HG引起的HUVECs的細(xì)胞毒性;
　　5.壞死性凋亡抑制劑、RIP3-siRNA及p38MAPK抑制劑對抗HG誘導(dǎo)的H

6、UVECs內(nèi)ROS產(chǎn)生;
　　6.壞死性凋亡抑制劑、RIP3-siRNA及p38MAPK抑制劑對抗HG誘導(dǎo)的HUVECs的MMP丟失;
　　7.壞死性凋亡抑制劑、RIP3-siRNA及p38MAPK抑制劑對抗HG誘導(dǎo)的HUVECs的炎癥反應(yīng)，使IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α分泌水平降低;;
　　8.壞死性凋亡及細(xì)胞凋亡存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用;
　　8.1HG上調(diào)HUVECs的cleaved caspase

7、d-3表達(dá);
　　8.2壞死性凋亡抑制劑Nec-1促進(jìn)cleaved caspase-3及caspase-9蛋白表達(dá);
　　8.3凋亡抑制劑Z-VAD促進(jìn)RIP3蛋白表達(dá);
　　9.p38MAPK通路與壞死性凋亡通路存在正反饋調(diào)節(jié)。
　　二、H2S通過抑制p38MAPK/壞死性凋亡通路保護(hù)HUVECs對抗HG誘導(dǎo)的損傷及炎癥
　　1.H2S抑制HG對HUVECs的p-p38MAPK表達(dá)的上調(diào)作用;
　

8、　2.H2S抑制HG對HUVECs的RIP3表達(dá)的上調(diào)作用;
　　3.H2S通過抑制p38MAPK/壞死性凋亡通路減輕HG引起的HUVECs的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率增加;
　　4.H2S減輕HG誘導(dǎo)的HUVECs凋亡;
　　5.H2S通過抑制p38MAPK/壞死性凋亡通路減少HG誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)ROS產(chǎn)生;
　　6.H2S通過抑制p38MAPK/壞死性凋亡通路減輕HG對HUVECs線粒體損傷作用;