載DOX-IR-780脂質(zhì)體的制備及其在乳腺癌光熱-化療聯(lián)合治療中的應(yīng)用.pdf

1、乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，其主要治療方式是手術(shù)、放療、化療。然而，手術(shù)治療和放療、化療對病人損傷較大，且化療普遍面臨著多藥耐藥的問題。因此，尋找一種非侵入的病人能耐受的腫瘤治療方法是臨床研究的熱點。熱療是通過各種方法使全身和（或）局部組織加熱至有效治療的溫度范圍并維持一定時間來殺滅腫瘤細胞的一種方法。熱療本身對腫瘤細胞有直接的殺傷作用，熱療能使癌細胞的線粒體膜、溶酶體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜發(fā)生破壞，并且由于溶酶體酸性水解酶的大量釋放，導

2、致胞膜破裂，胞漿外溢;造成DNA損傷的增加及抑制DNA的合成;影響相關(guān)基因，促進腫瘤細胞凋亡。激光熱療相較于手術(shù)、放療、化療，有著無創(chuàng)或微創(chuàng)，恢復時間短，并發(fā)癥少的優(yōu)點。但由于腫瘤內(nèi)部熱分布不均勻，尤其是在大血管周邊區(qū)域，熱量隨著血液循環(huán)消散，單純熱療很難殺死所有腫瘤細胞，治療結(jié)果差異大。因此，仍需要聯(lián)合其他治療方法來提高熱療的療效，臨床研究表明，熱療-化療的聯(lián)合治療可以明顯增強抗腫瘤療效。
　　本研究設(shè)計并構(gòu)建了一種基于溫度敏感

3、性脂質(zhì)體載阿霉素和IR-780的腫瘤熱療化療聯(lián)合治療的藥物控釋系統(tǒng)。該系統(tǒng)中，脂溶性的IR-780包封在脂質(zhì)雙層中，水溶性的化療藥阿霉素(Doxorubicin，DOX)包裹在脂質(zhì)體的親水內(nèi)核中。該系統(tǒng)可利用脂質(zhì)體高效負載化療藥物，在近紅外激光照射下光熱制劑吸熱同時促進溫度敏感性脂質(zhì)體的藥物釋放。經(jīng)過和修飾后的納米粒具有很好的生物相容性和很低的生物毒性，可避免單核巨噬系統(tǒng)的吞噬。在細胞學實驗和動物實驗中，該系統(tǒng)能夠同時發(fā)揮熱療與化療的聯(lián)

4、合治療效果，熱化療相比單純的化療或熱療，可顯著提高抗腫瘤效果。
　　第一章:載DOX/IR-780脂質(zhì)體的制備與表征
　　目的:
　　制備DOX/IR-780脂質(zhì)體并進行表征，探索其用于乳腺癌光熱-化療的可行性。
　　方法:
　　一、主要試驗材料
　　實驗材料:磷脂(DPPC，MPPC，DSPE-PEG2000);阿霉素;IR-780碘化物。
　　實驗儀器:恒溫金屬浴;Malvern激光粒度儀;

5、熒光分光光度計;紅外熱像儀。
　　二、實驗方法
　　采用薄膜水化法制作DOX/IR-780溫敏脂質(zhì)體(DOX-IR-780temperature-sensitive-liposomes， DITSL)及 DOX溫敏脂質(zhì)體(DOXtemperature-sensitive-liposomes， DTSL)、 IR-780溫敏脂質(zhì)體(IR-780temperature-sensitive-liposomes，ITSL)并對各脂質(zhì)

6、體進行表征。用Malvem激光粒度儀測得各脂質(zhì)體的粒徑、表面電位及多分散系數(shù)。同時對各脂質(zhì)體的紫外吸光特性及光熱效應(yīng)進行測量。并驗證DITSL在高溫及激光輻照下的藥物釋放可控性。
　　結(jié)果:
　　1.成功制備載有DOX和IR-780脂質(zhì)體，其中IR-780溶在脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層中，DOX包封在脂質(zhì)體的親水內(nèi)核中。
　　2.DITSL粒徑在138.98nmnm左右，PDI約0.32。DTSL、ITSL和空白脂質(zhì)體的粒徑均小于

7、100nm。所有脂質(zhì)體略帶負電位。各載藥溫敏脂質(zhì)體藥物包封率均在90％以上。DITSL同時在793nm和492nm有顯著吸收峰，符合IR-780和DOX的吸收特性。
　　3.在0.8W/cm2激光照射五分鐘內(nèi)，DITSL和ITSL溶液溫度升高迅速，而DTSL和PBS組只有少量的溫度升高。
　　4.在37℃、42℃和50℃金屬浴的條件下，DOX/IR-780溫敏脂質(zhì)體(DOX/IR-780 Temperature-Sensit

8、ive-Liposomes，DITSL)在37℃時脂質(zhì)體釋藥緩慢，而在42℃和50℃藥物迅速釋放。同時，DITSL在沒有激光輻照的條件下，5分鐘的DOX累積釋放率為8.9％。而在激光輻照的條件下，DOX迅速從DITSL釋放，局部藥物濃度隨之增高。DTSL由于無IR-780，在激光輻照下藥物釋放緩慢。說明了DITSL在聯(lián)合治療中具有良好的激光可控性及溫度敏感性。
　　結(jié)論:
　　DITSL具有合適的粒徑大小、較高的藥物包封率和

9、很好的光熱轉(zhuǎn)化效率。同時DITSL具有對溫度敏感的特性，其藥物釋放可被光熱治療控制，適宜用于乳腺癌的光熱-化療聯(lián)合治療（熱化療）。
　　第二章:載DOX/IR-780脂質(zhì)體熱化療治療乳腺癌的體外實驗
　　目的:
　　探討激光輻照下DOX/IR-780脂質(zhì)體對乳腺癌細胞的影響。
　　方法:
　　一、主要試驗材料
　　實驗材料:磷脂(DPPC，MPPC，DSPE-PEG2000);阿霉素;IR-780碘化

10、物;細胞活性檢測試劑盒;凋亡試劑盒;DAPI染料;細胞培養(yǎng)基;胎牛血清;胰酶;乳腺癌4T1細胞。
　　實驗儀器:FACSCantoⅡ流式細胞儀;Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡;多功能酶標儀。
　　二、實驗方法
　　通過FACSCantoⅡ流式細胞儀檢測4T1細胞在孵育不同濃度的DITSL條件下，細胞對藥物的攝取情況，并采用激光共聚焦顯微鏡對藥物在細胞內(nèi)的亞細胞定位進行分析。采用CCK-8方法檢測4T1細胞在

11、不同激光輻照強度(0.6W/cm2;0.8W/cm2)下的存活率，通過對凋亡細胞染色直接觀察4T1細胞在化療-光熱聯(lián)合治療后的凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.4T1細胞對DITSL、DTSL及ITSL的攝取有一定的劑量和時間依賴性。激光共聚焦顯示4T1細胞在吞噬DITSL后，脂質(zhì)體破壞后釋放的DOX富集在腫瘤細胞核，而IR-780富集在細胞質(zhì)中。
　　2.激光和高溫可以促進DITSL在4T1細胞內(nèi)的藥物釋放。
　

12、　3.與空白對照組相比，溫敏脂質(zhì)體載體及ITSL處理組細胞活性無明顯差別，而單純化療組與單純熱療組細胞活性分別下降了40.6％和56.4％。在化療和熱療聯(lián)合治療后，細胞存活率只有19.7％，遠低于其他各組。加強激光強度后，單純熱療組及聯(lián)合治療組細胞活性進一步降低。
　　4.與空白對照組相比，熱化療可明顯誘導腫瘤細胞凋亡/壞死，細胞凋亡/壞死情況與細胞活性情況一致。
　　結(jié)論:
　　熱療聯(lián)合化療可明顯抑制4T1乳腺癌腫瘤

13、細胞的活性，誘導腫瘤細胞凋亡/死亡。
　　第三章:載DOX/IR-780脂質(zhì)體熱化療對乳腺癌抑制效應(yīng)的動物實驗
　　目的:
　　探討DOX/IR-780脂質(zhì)體熱化療對乳腺癌移植瘤的作用。
　　方法:
　　一、主要試驗材料
　　實驗材料:磷脂(DSPC，DPPC，MPPC，DSPE-PEG2000);阿霉素;IR-780碘化物;細胞培養(yǎng)基;胎牛血清;胰酶;乳腺癌4T1細胞;兔抗鼠CD31單克隆抗體單步法

14、測凋亡（TUNEL）檢測試劑盒;DBA kit;蘇木精染色液;伊紅染色液。雌性SPF級BALB/c小鼠，鼠齡8～10周齡，體重18～22g，由廣東省動物中心提供(SCXY[粵]2013-0002)，飼養(yǎng)在中科院深圳先進技術(shù)研究院SPF級實驗室。
　　實驗儀器:CO2細胞培養(yǎng)箱;超凈工作臺;離心機;普通光學顯微鏡;倒置熒光顯微鏡;石蠟切片機;正置顯微鏡;Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡;紅外熱像儀。
　　方法:用BA

15、LB/c小鼠建立4T1乳腺癌皮下移植瘤模型，隨機將荷瘤小鼠分為(1)對照組;(2)激光組;(3)化療組;(4) IR-780脂質(zhì)體組;(5)光熱治療組;(6) DOX/IR-780脂質(zhì)體組及(7)聯(lián)合治療組。各組處理后觀察小鼠腫瘤體積和體重的變化情況，記錄分析小鼠生存率，研究DOX/IR-780熱化療體內(nèi)治療效果。腫瘤組織經(jīng)H&E染色觀察組織形態(tài)學變化和TUNEL免疫組化檢測組織凋亡情況。同時，各組在治療后，采用超聲造影對基于DITSL

16、的乳腺癌熱化治療的療效進行評價，并采用B超成像檢測腫瘤內(nèi)部回聲的變化。應(yīng)用CD31免疫組織化學染色檢測乳腺腫瘤中新生微血管密度及血管的分布情況。
　　結(jié)果:
　　1.以腫瘤切片H&E染色和TUNEL檢測來評價小鼠治療后短期療效，H&E染色結(jié)果可見在熱化療后，小鼠腫瘤組織大部分細胞的細胞核已不見，細胞壞死顯著增多。而TUNEL結(jié)果也顯示在熱化療后，腫瘤組織細胞凋亡增加。
　　2.長期來看，單獨化療或光熱治療后，小鼠腫瘤體

17、積縮小，腫瘤生長受到抑制，而聯(lián)合治療之后，小鼠腫瘤較各組體積縮小明顯(P＜0.01)。小鼠在熱化療30天的生存率為100％，而PBS的30天生存率為0％。
　　3.處理48h后，超聲造影顯示熱化療組的腫瘤區(qū)域血流灌注減少。治療48h后的超聲成像顯示熱化療組腫瘤體積縮小，回聲減低。
　　4.CD31免疫熒光染色結(jié)果表明，腫瘤組織在DITSL脂質(zhì)體熱化療后，CD31陽性細胞明顯減少，與超聲造影結(jié)果一致。
　　結(jié)論: