免疫球蛋白對大鼠皮膚移植的影響及機制研究.pdf

1、背景和目的:皮膚是人體面積最大的免疫器官，能夠阻止外界有害物質的侵入，同時，也是對任何病原體有效作用的第一道防線，跟外界形成了天然屏障。全層皮膚損傷的主要原因是皮膚損害、燒傷和難以愈合的潰瘍等，這是困擾著臨床的一個難以解決的問題。目前，主要的治療方法是皮膚移植，包括自體移植、同種異體移植和異種移植,從而使破損的皮膚最快愈合。但是,皮膚排斥仍然是移植重建的一個主要障礙。在1952年，人類第一次報道免疫球蛋白作為治療藥物使用,由Ogden

2、Bruton對一個與病史無關的持續(xù)嚴重感染性疾病的8歲男孩進行治療。從那以后，免疫球蛋白被用于不同的疾病，其中包括：肺部、腎臟、心臟和肝臟移植等。免疫球蛋白(Ig)每年的需求正在穩(wěn)步增加,在過去15年里增加了兩倍，在2012年達到130公噸。但是,目前的治療方式主要以靜脈注射為主。由于靜脈注射并不適合所有患者(如：皮膚潰瘍損傷患者)，出于此原因,皮下注射免疫球蛋白(SCIG)將作為替代靜脈注射的另一種方式出現(xiàn)。
　　目前IgG作為

3、治療抑制皮膚移植術后排斥的藥物尚未見報道，本研究通過不同方式及劑量對移植皮膚大鼠進行注射IgG，觀察大鼠皮瓣存活時間。并在移植皮瓣術后第4天，通過HE染色了解移植皮膚組織病理學變化，通過ELISA及QAR-CYT-3芯片檢測血液中相關細胞因子的水平，通過白細胞分類和肝腎功能檢查了解不同組別之間機體的炎癥反應及毒性，通過流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+和Foxp3+T細胞的數(shù)量。以期揭示IgG對皮膚移植最適宜的的劑量及用藥方式，

4、并試圖闡明其可能作用的機制。
　　材料與方法:
　　1、動物模型制備及分組8～10周齡，雌雄各半,SPF級，體重250±10g,由汕頭大學醫(yī)學院提供。經(jīng)腹腔注射麻醉并移植后，其中36只分為6組，分別皮下注射PBS及0.1、0.5、1、2、5mg IgG，觀察皮瓣的排斥情況。另外36只分為6組，分別尾靜脈注射PBS及0.1、0.5、1、2、5mg IgG，觀察皮瓣的排斥情況。剩余48只注射量為1mg IgG,根據(jù)注射方式不同，

5、隨機分為4組：PBS-Inj組（移植后，注射PBS），Intra-Inj組（移植后，腹腔內注射1mg IgG），IvIg組（移植后，尾靜脈注射1mg IgG）, Sub-Inj組（移植后，移植部位皮下注射1mg IgG）。每組大鼠為12只，其中6只進行皮瓣排斥時間觀察，6只大鼠在術后第4天進行各項指標的檢測。另外，選擇6只正常大鼠，未進行任何處理，作為各項指標的正常對照。
　　2、尾靜脈及皮下注射不同劑量IgG的觀察通過注射IgG

6、后，用照相機記錄下每天不同組別皮瓣的排斥情況。
　　3、移植皮瓣的存活時間經(jīng)移植后，記錄下各組皮瓣的排斥時間。
　　4、病理學觀察移植4天后，由病理科醫(yī)師觀察各組移植皮膚的情況。
　　5、白細胞分類檢測皮膚移植4天后各組血液中淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的變化。
　　6、肝腎功能檢查檢測皮膚移植4天后各組血液中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐及尿素氮的變化。
　　7、ELISA檢測

7、皮膚移植4天后各組血液中分泌細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的水平。
　　8、QAR-CYT-3芯片檢測皮膚移植4天后各組血液中細胞因子B7-2b、NGF、CINC-1、CINC-2、CINC-3、CNTF、Fractalkine、GM-CSF、ICAM-1、IFNg、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、LIX、IL-13、L-Selectin、MCP-1、PDGF-AA

8、、Prolactin R、RAGE、TCK-1、TIMP-1、TNFa、VEGF的變化。
　　9、流式細胞儀檢測皮膚移植4天后各組血液中CD3+、CD4+、CD8+和Foxp3+T細胞的變化。
　　結果:
　　1、IvIg組及Sub-Inj組1mgIgG的皮瓣存活時間最長，且開始排斥的時間最晚；
　　2、從皮膚生存率曲線可見到，Sub-Inj組的皮膚耐受時間最長；
　　3、皮膚移植術后4d，根據(jù)病理情況，可

9、見到Sub-Inj組的移植皮膚排斥反應最少；
　　4、皮膚移植術后4d，Sub-Inj組淋巴細胞及中性粒細胞明顯低于其他組；
　　5、皮膚移植術后4d，PBS-Inj組及Intra-Inj組的肝腎功能損害明顯比正常組、IvIg組及Sub-Inj組嚴重；
　　6、皮膚移植術后4d，通過ELISA檢測，Sub-Inj組IL-4及IL-10高于其他組；
　　7、皮膚移植術后4d，QAR-CYT-3芯片檢測Sub-Inj

10、組IL-1α、IL-2、L-Selectin、GM-CSF、B7-2、Fractalkine及ICAM-1低于其他組，Sub-Inj組IL-4、IL-10、MCP-1高于其他組；
　　8、皮膚移植術后4d，流式細胞儀檢測Sub-Inj組的CD3+細胞是比PBS-Inj組、Intra-Inj組及IvIg組減低，Sub-Inj組在CD4+/CD8+的細胞比例當中比PBS-Inj組、Intra-Inj組及IvIg組升高；Sub-Inj組

11、和IvIg組的CD4+CD25+Foxp3+T細胞比PBS-Inj組、Intra-Inj組升高，差異統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論:
　　1、IgG能使大鼠移植皮膚耐受時間延長，在不同的劑量當中，無論是靜脈注射或者是皮下注射IgG，都是注射1mgIgG的皮瓣存活時間最長，且開始出現(xiàn)排斥的時間最晚。而注射0.1、0.5、2、5mgIgG都較早皮瓣就已經(jīng)排斥完畢。說明注射 IgG的劑量太少起不到作用，而太大可能加速了排斥

12、。
　　2、在不同的注射方式當中，Sub-Inj組的皮膚耐受時間最長，效果最好，肝腎功能損害最小，其機制可能是：
　　1）由于CD4+CD25+Foxp3+Tregs細胞活躍的原因；
　　2）由于局部發(fā)生了抗原抗體免疫反應，阻止了對內皮細胞及上皮組織等的損害，從而保護了移植皮膚的血管免受損害，使移植物的排斥時間延長；
　　3）在此過程中細胞因子IL-4、IL-10、MCP-1的活化，細胞因子IL-1α、IL-2、