基于BAC同源重組技術(shù)構(gòu)建小鼠胚胎干細(xì)胞Nanog基因報(bào)告體系及其鑒定.pdf

1、胚胎干細(xì)胞具有的自我更新及多向分化潛能兩大特性，是細(xì)胞移植治療手段的首選來(lái)源，也成為近年研究的熱門(mén)領(lǐng)域。 本研究運(yùn)用基于BAC的同源重組技術(shù)構(gòu)建小鼠胚胎干細(xì)胞(mES細(xì)胞)Nanog基因報(bào)告體系。首先挑選包含Nanog基因啟動(dòng)子的BAC，通過(guò)同源重組，直接從BAC上套取Nanog啟動(dòng)子。再次同源重組，將報(bào)告基因插入Nanog/EGFP插入Nanog基因啟動(dòng)子之后，高效構(gòu)建了Naong/EGFP打靶載體。通過(guò)電穿孔的方法，將打靶

2、載體導(dǎo)入mES細(xì)胞系R1中，篩選后獲得基因打靶的陽(yáng)性細(xì)胞R5。經(jīng)鑒定，R5與R1分化前具有相似的基因表達(dá)情況；R5與R1具有形成EB(embryonic body)的能力。用RT-PCR分析此兩種EB，結(jié)果表明，R5及R1所形成的EB均表達(dá)內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的標(biāo)志基因SOX17、Nkx2.5及Nestin。由此說(shuō)明，打靶后的mES細(xì)胞R5具有與mES細(xì)胞R1相似的特性。同時(shí)，用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對(duì)自發(fā)分化前后的R5細(xì)胞進(jìn)行OCT4的標(biāo)染