紅花黃酮類生物合成途徑查爾酮合酶基因的功能研究.pdf

1、黃酮類化合物作為一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有廣泛的藥理活性，決定著許多中藥材的品質(zhì)。因此，研究黃酮類生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的功能對于闡明中藥品質(zhì)形成的分子機制具有重要意義。紅花（Carthamus tinctorius L.）是著名的藥用植物，其花活血通經(jīng)、散瘀止痛，具有抗凝血、抗氧化、耐缺氧、防治血栓形成等多種藥理作用，是活血祛瘀類的代表中藥。紅花中含有的查爾酮類成分和多種黃酮醇化合物如羥基紅花黃色素A、槲皮素及其苷類、山柰酚及其苷類

2、等是紅花發(fā)揮活血化瘀活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。但是，由于植物次生代謝生物合成途徑的極其復(fù)雜性，加之紅花的品質(zhì)成分羥基紅花黃色素A(HSYA)僅在花中特異性積累、紅花本身的組織培養(yǎng)再生率低以及生根困難等問題，一直以來對紅花黃酮生物合成途徑的研究進展相當(dāng)緩慢，制約著通過植物基因工程手段提高紅花品質(zhì)的步伐。大量研究表明，查爾酮合酶是黃酮類化合物形成的入口酶，調(diào)控著黃酮類成分的合成，因此，深入研究紅花查爾酮合酶基因的功能，對于闡釋紅花品質(zhì)形成的分子機

3、制、進而從基因水平定向調(diào)控紅花的品質(zhì)具有重要意義。
　　課題組前期在構(gòu)建紅花花冠cDNA文庫、進行基因測序和注釋以及定制紅花原位合成基因芯片比較不同開花時間點花冠基因表達差異的基礎(chǔ)上，獲得了紅花中HSYA時序性差異表達的基因，并通過KOBAS分析，獲得了KEGG數(shù)據(jù)庫中黃酮代謝途徑通路上顯著性差異表達的基因，如:肉桂酸4-羥基化酶(C4H)、查爾酮合酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮2-羥基化酶(F2H)、AT4G333

4、60基因等。并克隆了查爾酮合酶(chalcone synthase，CHS)基因CtCHS533等黃酮代謝途徑的多條關(guān)鍵酶基因。
　　本論文在上述研究工作的基礎(chǔ)上，應(yīng)用cDNA末端快速擴增(rapid amplificationof cDNA ends，RACE)技術(shù)，繼續(xù)克隆紅花的CHS基因，獲得2條紅花CHS基因全長:CtCHS3720、CtCHS1515。生物信息學(xué)分析顯示CtCHS3720氨基酸序列與菊花（Chryscan

5、themum boreale）CHS氨基酸序列(AGU91424.1)的同源性最高，覆蓋度達94％，匹配度達到91％。依據(jù)protparam預(yù)測CtCHS3720全長序列編碼的蛋白質(zhì)分子量為43667.25Da，預(yù)測理論等電點為5.72。CtCHS1515氨基酸序列與毛果楊(Populus trichocarpa)CHS氨基酸序列(XP006375238.1)的同源性最高，覆蓋度達93％，匹配度達到82％。依據(jù)protparam預(yù)測Ct

6、CHS1515全長序列編碼的蛋白質(zhì)分子量為43016.36Da，預(yù)測理論等電點為5.67。依據(jù)系統(tǒng)進化樹圖譜分析，CtCHS3720、 CtCHS533和CtCHS1515在聚類分支上距離較遠，推測3個CHS基因在氨基酸活性催化功能上存在較大差異性。
　　為了深入研究紅花的3個CHS基因，本論文以課題組前期研究發(fā)現(xiàn)并經(jīng)多代純化選擇獲得的紅花不同化學(xué)型（即以HSYA為主成分的HSYA型和以山柰酚及其苷類為主的KAEG型，云南巍山紅花

7、和新紅花7號）為材料，均勻種植于溫室，以茉莉酸甲酯(MeJA，100μM)分別刺激開花當(dāng)天的花冠，采用qPCR法，于刺激后0.1h，3h，6h，12h分析3個基因CtCHS3720、CtCHS1515、CtCHS533的相對表達量。結(jié)果表明，3個基因響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)的模式因品系不同而不同。CtCHS3720基因的表達量在誘導(dǎo)云南巍山紅花的0.1h、3h和6h明顯升高，特別在誘導(dǎo)6h，表達量提高了2.3倍，誘導(dǎo)12h，則沒有明顯變化;而M

8、eJA誘導(dǎo)新紅花7號后，CtCHS3720基因的表達量則有所降低，在誘導(dǎo)后的6h和12 h降低最明顯。CtCHS1515基因的表達量在誘導(dǎo)云南巍山紅花0.1h、3h、6h和12h明顯降低;CtCHS1515基因在誘導(dǎo)新紅花7號的不同時間點表達量均較低，對MeJA的誘導(dǎo)響應(yīng)也不明顯;CtCHS533基因在云南巍山紅花的3h、6h和12h，表達量均降低，而MeJA在新紅花7號誘導(dǎo)的0.1h表達量明顯上升，誘導(dǎo)3h、6h和12h則沒有明顯變化

9、。提示CtCHS3720、CtCHS1515和CtCHS533基因?qū)t花黃酮類生物合成途徑的貢獻度因品系不同而不同，可能參與了紅花不同化學(xué)型品系的形成過程。
　　UPLC-QTOF/MS檢測MeJA誘導(dǎo)后不同時間點(0.1 h、3h、6h、12 h)紅花不同品系花冠12個黃酮類成分D-Phenylalanine、Hydroxysaffloryellow A、Rutin、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside、Ka

10、empferol-3-O-β-rutinoside、Kaempferol、Apigenin、Dihydrokaepferol、Quercetin3-β-D-glucoside、Scutellarin、Carthamin、Luteolin的積累情況，從含量變化折線圖可以看出，不同品系12個黃酮成分均受到MeJA的誘導(dǎo)，但成分種類和積累模式存在明顯不同。Hydroxysaffloryellow A、Carthamin、Luteolin、Ka

11、empferol-3-O-β-D-glucoside僅在云南巍山紅花中有積累，而且Hydroxysaffloryellow A的積累量遠遠高于其他黃酮成分，特別在誘導(dǎo)的3h、6h，D-Phenylalanine、Kaempferol-3-O-β-rutinoside、Carthamin的積累量均高于對照組，Kaempferol、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside、Luteolin、Quercetin-3-β-D-g

12、lucoside的積累則受到不同程度的抑制。Dihydrokaepferol、Apigenin、Scutellarin僅在新紅花7號中有積累，特別在在誘導(dǎo)的0.1 h、3h、6h，Apigenin、D-Phenylalanine、Dihydrokaepferol、Kaempferol、Quercetin-3-β-D-glucoside、的積累被抑制，而Kaempferol-3-O-β-rutinoside、Rutin則持續(xù)升高，而Scu

13、tellarin在4個時間點積累均受到抑制，提示紅花不同品系黃酮成分的種類與積累模式的不同可能是導(dǎo)致不同化學(xué)型形成的重要原因。
　　整合分析CtCHS3720、CtCHS1515和CtCHS533基因響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)的表達量與黃酮類化合物積累量的關(guān)聯(lián)分析顯示，云南巍山紅花Hydroxysaffloryellow A、D-Phenylalanine、Carthamin的積累量與CtCHS3720的表達均成正相關(guān)(r=0.92、0.8

14、8、0.76);提示CtCHS3720、CtCHS533可能是云南巍山紅花形成HydroxysaffloryellowA和Carthamin的關(guān)鍵基因; CtCHS1515在新紅花7號中與Scutellarin的積累有正相關(guān)關(guān)系(r=0.64)，可能是新紅花7號形成Scutellarin的關(guān)鍵基因。
　　采用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建了CtCHS3720與真核表達載體pMT39的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化了LBA4404農(nóng)桿菌。洋蔥表皮的亞細胞定位顯示

15、，CtCHS3720基因在細胞膜和細胞核表達。
　　將構(gòu)建的原核表達重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達宿主菌體BL21(DE3)pLysS中，加入IPTG誘導(dǎo)表達融合蛋白。CtCHS3720和CtCHS1515分別編碼分子量為43.6kD和43kD的蛋白質(zhì)。體外構(gòu)建酶促反應(yīng)體系驗證CtCHS3720所編碼酶可催化1分子的香豆酰COA(p-coumaryl-COA)和3分子的丙二酰COA(malonyl-COA)生成柚皮素，證明CtCHS37