攀西金龍膽草種質(zhì)資源及其查爾酮合酶基因和β-香樹酯合酶基因的克隆研究.pdf

1、金龍膽草（Conyza blinii H.Lév.）是一種菊科白酒草屬植物，主要呈野生狀態(tài)，分布于四川攀西地區(qū)、云南中南部及貴州部分地區(qū)。其活性成分在慢性支氣管炎、胃潰瘍等疾病的治療上具有良好療效。多年來，金龍膽草的研究集中在化學成分種類和主要活性成分藥理藥效等方面，對其有效成分含量的研究卻鮮見報道，基于分子生物學層面的研究更屬于空白領域。
　　本研究廣泛收集了金龍膽草資源在主產(chǎn)區(qū)攀西地區(qū)的分布信息，對采集的樣品利用ICP-AES

2、手段進行了無機元素含量檢測，利用紫外分光光度法進行了總黃酮和總皂苷含量的檢測，利用高效液相色譜法進行了蘆丁、槲皮素和苦蒿素含量的檢測;通過RAPD、SRAP和SCAR分子標記對該區(qū)域內(nèi)野生金龍膽草居群間的遺傳多樣性進行了研究;利用RACE技術克隆了金龍膽草黃酮代謝途徑的關鍵酶查爾酮合酶基因和三萜皂苷代謝途徑的關鍵酶β-香樹酯合酶基因。主要結(jié)果如下:
　　1.以攀西地區(qū)野生金龍膽草生長環(huán)境為背景，研究了金龍膽草的生長環(huán)境和植物形態(tài)，

3、發(fā)現(xiàn)金龍膽草在不同的生長時期植物形態(tài)變化較大。比較了野生和人工栽培植株葉片的超顯微結(jié)構(gòu)，掃描電鏡結(jié)果顯示，除人工栽培品種的葉片上偶可觀察到圓形氣孔外，兩類葉片的腺毛、非腺毛、表皮等的顯微差別并不大。
　　2.無機元素的含量檢測結(jié)果顯示，5個不同來源的金龍膽草均不含重金屬Cr和Cd，而Fe/Mn含量均較高，除Al元素顯示出涼山州樣品明顯較多外，其它元素在樣品間的含量較為相似。對16個不同來源的金龍膽草進行了總黃酮和總皂苷含量的檢測，

4、總黃酮含量較高，在4.660％～7.530％之間;對花期植株花、葉、莖、根四個組織部位的黃酮成分蘆丁、槲皮素進行了測定，發(fā)現(xiàn)蘆丁和槲皮素含量均為葉中最高，含量分別占總黃酮成分的0.478％和0.158％。三萜總皂苷的含量在0.566％～0.909％之間，且以葉中最高;二萜成分苦蒿素的含量在0.560％～1.185％之間，以葉中含量最高。
　　抗氧化實驗顯示金龍膽草粗提物及分離純化的總皂苷對DPPH自由基和羥自由基均有較好的抑制作用

5、。以總黃酮、總皂苷和苦蒿素含量為指標，將攀西16個來源的金龍膽草聚為四大類，聚類的結(jié)果顯示有效成分含量的相似性并不完全與其所處地理位置的遠近相關，說明野生金龍膽草次生代謝物的產(chǎn)生不僅與地理位置有關，還可能與縱向海拔等生長地的小物候環(huán)境有關。
　　3.利用RAPD和SRAP分子標記技術對16個不同來源地金龍膽草進行了遺傳多樣性研究，15條RAPD引物和12對SRAP引物分別獲得140個和318個多態(tài)位點，平均相似系數(shù)分別為0.673

6、2和0.6804。合并的RAPD-SRAP標記結(jié)合了兩種標記的特點，得到平均遺傳相似性為0.6787，數(shù)據(jù)顯示金龍膽草在攀西地區(qū)遺傳多樣性并不豐富，這可能與該植物生長地較集中，區(qū)域內(nèi)能進行基因交流的國土面積不大有關。RAPD-SRAP標記將16個不同來源樣品聚為三類，聚類結(jié)果與地理位置十分相關，來自攀枝花市的樣品和涼山州的8、9樣被聚為Ⅰ類，涼山的10和11樣被聚為Ⅱ類，其余涼山州的樣品聚為第Ⅲ類，顯示了攀西地區(qū)野生金龍膽草居群間的親緣

7、關系與地理分布較高的關系。
　　RAPD轉(zhuǎn)化的SCAR標記研究結(jié)果顯示，金龍膽草SCAR標記為共顯性標記，16個樣品的SCAR特異片段同源性較高(71.32％)。利用該標記能快速明確地將金龍膽草與其易混淆植物艾草、木里白酒草和黃花蒿區(qū)分開來。著重研究了黃花蒿與金龍膽草的特異鑒別，結(jié)果顯示，理想狀態(tài)下黃花蒿藥材中僅含有5％金龍膽草時，SCAR標記便能快速靈敏地鑒別出金龍膽草的蹤影。
　　4.本研究利用RACE技術從金龍膽草中克

8、隆得到黃酮途徑關鍵酶查爾酮合酶基因和三萜皂苷合成途徑β-香樹酯合酶基因，分別命名為CbCHS和CbβAS∶
　　CbCHS（GenBank登錄號KJ155749）包含有一個長為1197bp的開放閱讀框，編碼的蛋白序列與其它植物有高度的同源性，在第63位半胱氨酸密碼子內(nèi)第1位和第2位堿基之間、第294位甘氨酸密碼子內(nèi)第1位和第2位堿基之間分別含有1個415bp的內(nèi)含子和1個486bp大小的內(nèi)含子，這與植物查爾酮合酶家族普遍含有1個內(nèi)

9、含子情況的有所不同。CbCHS編碼的蛋白具有查爾酮合酶家族的特征多肽序列GVLFGFGPGL，和必需的活性位點Cys(C)167、His(H)306和Asn(N)339;半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示金龍膽草花期CbCHS表達量為莖＞葉＞花＞根。表達量與有效成分含量相關性分析顯示花器官中CHS的表達量與花青素相對含量，蘆丁、槲皮素含量有極顯著的正相關關系，r值均趨于1。構(gòu)建原核表達載體pET-CbCHS進行原核表達分析，SDS-PAGE

10、檢測結(jié)果顯示誘導得到了43.5kD左右的融合蛋白，表明CbCHS基因在E.coli BL21中成功表達。
　　5.CbβAS（GenBank登錄號KJ650043）包含有一個長為2151bp的開放閱讀框，全長cDNA序列比對顯示其編碼的氨基酸與其它植物的βAS基因具有較高的同源性，序列包含該基因家族特有的DCTAE保守序列和QW保守序列。半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示金龍膽草花期CbβAS的表達量為葉＞莖＞花＞根，各個部位的三萜總