SP1 Decoy ODN聯(lián)合Elk1-UTE1 Decoy ODNs通過(guò)矯正細(xì)胞外基質(zhì)失衡抑制大鼠肝星狀細(xì)胞活化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：將SP1 Decoy ODN與SMAD3/STAT3/Elk1 Decoy ODNs聯(lián)合作用于活化的肝星狀細(xì)胞（HSC），篩選并確認(rèn)能有效抑制HSC活化，下調(diào)Ι型膠原蛋白（COLΙ）表達(dá)的Decoy ODNs組合；將SP1/UTE1 Decoy ODNs聯(lián)合作用于活化的HSC后，確認(rèn)其能否有效的靶向下調(diào) TIMP1的表達(dá)，進(jìn)而是否能抑制 HSC活化和增殖，增加COLΙ的降解。
　　方法：(1)通過(guò)分子克隆構(gòu)建TIMP1啟動(dòng)子

2、驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒；(2)針對(duì)本課題組前期篩選的6個(gè)有效的Decoy ODNs，將其中的SP1 Decoy ODN分別聯(lián)合SMAD3/STAT3/Snail/Elk1/UTE1 Decoy ODNs，作用于HSC-T6后，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因分析法進(jìn)行篩選，Western blot檢測(cè)膠原蛋白、TGF-β、α-SMA和TIMP1等肝纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)；(3) SP1 Decoy ODN和UTE1 Decoy ODN聯(lián)合作用于HSC

3、-T6后，MTT法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了TIMP1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGLuc-P-TIMP1，與前期成功構(gòu)建的3個(gè)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(pGLuc-TRE-MiniTK、pGLuc-PSMA和pGLuc-P-COLΙα2)一起形成了較為完善的抗肝纖維化熒光素酶報(bào)告基因篩選平臺(tái)。(2)通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因篩選平臺(tái)初步確認(rèn)，較單一因素作用，SP1 Decoy ODN聯(lián)合SMAD3/STAT3/El

4、k1 Decoy ODNs，能進(jìn)一步下調(diào)TRE增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的GLuc表達(dá)，SP1 Decoy ODN聯(lián)合STAT3/Elk1 Decoy ODNs，能下調(diào)TIMP1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GLuc表達(dá)， SP1 Decoy ODN聯(lián)合Snail/Elk1 Decoy ODNs，能下調(diào)COLΙα2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GLuc表達(dá)， SP1 Decoy ODN聯(lián)合STAT3 Decoy ODN，能進(jìn)一步下調(diào)α-SMA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GLuc表達(dá)。Western bl

5、ot確認(rèn)，較單一因素作用，SP1 Decoy ODN聯(lián)合Elk1 Decoy ODN，能進(jìn)一步下調(diào)HSC-T6中COLΙα2的表達(dá)；SP1 Decoy ODN聯(lián)合Elk1 Decoy ODN比單一的SP1 Decoy ODN作用，更能下調(diào)HSC-T6中α-SMA的表達(dá)。(3)通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因篩選平臺(tái)初步確認(rèn)，較單一因素作用，SP1 Decoy ODN聯(lián)合UTE1 Decoy ODN，均能進(jìn)一步下調(diào)TIMP1、COLΙα2和α-SMA

6、啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)及TRE增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的GLuc表達(dá)；Western blot確認(rèn)，聯(lián)合作用較單一因素作用，能進(jìn)一步下調(diào)HSC-T6中TIMP1、COLΙα2和α-SMA的表達(dá)；MTT法顯示，聯(lián)合作用72小時(shí)后，較單一因素更能抑制HSC-T6的增殖。
　　結(jié)論：SP1 Decoy ODN聯(lián)合Elk1 Decoy ODN通過(guò)抑制α-SMA和COLΙα2啟動(dòng)子活性，進(jìn)而抑制HSC-T6的活化，下調(diào)COLΙα2的表達(dá)；SP1 Decoy ODN聯(lián)