過表達(dá)CRMP2對彌漫性軸索損傷后α7nAChR及Aβ的影響.pdf

1、目的：
　　研究過表達(dá)腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（collapsin response-mediator protein2，CRMP2）對大鼠彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury, DAI）后β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，β-APP)及β-淀粉樣蛋白(amyloidβ，Aβ)表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動物分組：實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、DAI組、AAV組

2、及CRMP2組。正常對照組動物入組即處死。AAV組及 CRMP2組分別注射空白 AAV病毒和AAV-CRMP2病毒，10天后予以DAI損傷。DAI組僅致傷，不注射病毒。各損傷組大鼠分別于傷后7、14、30天處死，取標(biāo)本保存待測。
　　2.DAI大鼠模型建立：利用本課題組自行研制的DAI致傷裝置建立大鼠DAI模型，該裝置可通過產(chǎn)生復(fù)合線加速和角加速運(yùn)動致傷（專利號：ZL200920067463.4、ZL200910056452.0、

3、ZL201520430079.1）。
　　3.病毒制備及注射：采用基因重組技術(shù)將CRMP2基因插入AAV表達(dá)載體，構(gòu)建AAV重組質(zhì)粒。通過重組AAV載體包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝病毒，并測定病毒滴度。AAV組和 CRMP2組的大鼠采用立體定向技術(shù)分別注射2ul空白AAV病毒及AAV-CRMP2病毒至右側(cè)海馬區(qū)。
　　4.組織學(xué)研究：各組大鼠深麻醉后處死取腦，腦組織固定24小時后石蠟包埋，利用免疫熒光技術(shù)定性觀察不同時

4、間點(diǎn)海馬組織α7nAChR和Aβ的表達(dá)情況。
　　5.α7nAChR和Aβ檢測：各組大鼠深麻醉后處死取腦，取右側(cè)海馬組織。采用Western blot、Real-time PCR技術(shù)定量評估α7nAChR蛋白及mRNA的動態(tài)變化，采用Elisa方法檢測 Aβ蛋白的表達(dá)變化。
　　6.統(tǒng)計學(xué)處理：使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間均數(shù)比較采用方差分析， p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
　　結(jié)果：
　　

5、1.組織學(xué)研究：α7nAChR和Aβ在大鼠海馬組織中均有表達(dá)。在免疫熒光顯微鏡下海馬組織中α7nAChR和Aβ免疫熒光反應(yīng)呈陽性，發(fā)出紅色熒光，胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。
　　2.海馬組織中α7nAChR表達(dá)：與正常對照組相比，DAI組與AAV組海馬組織中α7nAChR蛋白及mRNA水平在傷后各時間點(diǎn)均明顯降低（p＜0.05），但這兩組之間無明顯差異。CRMP2組較以上兩組明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），但仍低于正常組（p＜0.

6、05）。
　　3.海馬組織中Aβ表達(dá)：與正常對照組相比，在傷后各時間點(diǎn)DAI組和AAV組海馬組織中Aβ的表達(dá)均明顯升高（p＜0.05）。但DAI組和AAV組之間無明顯差異（P?0.05）。與DAI組和AAV組相比，CRMP2組Aβ的表達(dá)在損傷7、14天均明顯減低（p＜0.05），而在損傷30天無明顯差異；但DAI組、AAV組及CRMP2組Aβ的表達(dá)均高于正常組（p＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠DAI后海馬組織