慢性鼻-鼻竇炎中細(xì)菌生物膜與溶菌酶，SLPI和gp340關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是耳鼻咽喉頭頸外科的常見(jiàn)多發(fā)病，是鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。CRS的發(fā)病是多種致病因素交叉作用的結(jié)果，致病菌感染是其中重要因素之一。細(xì)菌生物膜是不同于游離菌的另一種細(xì)菌存在形式，由細(xì)胞外保護(hù)性基質(zhì)和包裹其中的細(xì)菌群落組成，是具有一定空間構(gòu)型的高度組織化的結(jié)構(gòu)。生物膜形成后，細(xì)菌對(duì)宿主免疫及抗生素類藥物的抵抗較游離菌大大增強(qiáng)。據(jù)估計(jì)，約65％的

2、人類慢性細(xì)菌性感染與生物膜有關(guān)。細(xì)菌生物膜在CRS患者鼻腔鼻竇黏膜表面的檢出率約為30-80%，可能是加重CRS病情的重要因素。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌是成人CRS的重要致病菌，目前認(rèn)為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜形成與CRS重癥化和難治化之間存在相關(guān)性。
　　固有免疫是機(jī)體抵御環(huán)境微生物的第一道防線。溶菌酶，分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑（secretory leukocyte proteinase inhibitor，SL

3、PI）和糖蛋白340（glycoprotein340，gp340）是鼻腔黏膜固有免疫應(yīng)答的重要蛋白，分別在識(shí)別，調(diào)控，殺菌等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。目前不同生物膜狀態(tài)的CRS中溶菌酶，SLPI和gp340的表達(dá)情況未見(jiàn)報(bào)道；國(guó)內(nèi)外關(guān)于溶菌酶，SLPI和gp340對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜的效應(yīng)研究較少。為此我們通過(guò)在臨床收集 CRS患者鼻竇黏膜標(biāo)本及在體外建立鼻竇黏膜離體組織模型和金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌生物膜模型，采用免疫組

4、化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR），Western blot，熒光標(biāo)記和激光共聚顯微鏡觀察等手段，就細(xì)菌生物膜對(duì)鼻竇黏膜溶菌酶，SLPI和gp340表達(dá)的調(diào)控以及溶菌酶，SLPI和gp340對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜的抑制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；以初步闡明細(xì)菌生物膜與上述固有免疫相關(guān)分子之間的相互作用，為進(jìn)一步研究CRS中細(xì)菌生物膜影響宿

5、主固有免疫可能的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為探索CRS新的治療途徑提供思路。
　　本研究由以下三部分組成：
　　第一部分：溶菌酶，SLPI和gp340在細(xì)菌生物膜相關(guān)慢性鼻-鼻竇炎中的表達(dá)
　　目的：
　　探討溶菌酶，SLPI和gp340在具有不同細(xì)菌生物膜狀態(tài)的慢性鼻-鼻竇炎患者鼻竇黏膜的表達(dá)情況。
　　方法：
　　收集CRS患者63名和對(duì)照組腦脊液鼻漏患者20名的篩竇黏膜樣本，以激光共聚顯微鏡觀察鼻竇黏膜樣

6、本表面細(xì)菌生物膜情況，分別以RT-PCR，免疫組化和Western blot檢測(cè)溶菌酶，SLPI和gp340在鼻竇黏膜中的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　35/63（55.6%）的 CRS患者細(xì)菌生物膜陽(yáng)性，對(duì)照組未檢出細(xì)菌生物膜。CRS患者溶菌酶，SLPI和gp340的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組上調(diào)；細(xì)菌生物膜陽(yáng)性CRS患者溶菌酶，SLPI和gp340的mRNA和蛋白表達(dá)水平較細(xì)菌生物膜陰性的CRS患者增強(qiáng)。
　　結(jié)論

7、：
　　溶菌酶，SLPI和gp340在鼻竇黏膜中呈組成性表達(dá)，CRS患者溶菌酶，SLPI和gp340在mRNA和蛋白水平的表達(dá)上調(diào)與細(xì)菌生物膜有關(guān)，CRS中細(xì)菌生物膜和固有免疫應(yīng)答的改變密切相關(guān)。
　　第二部分：金黃色葡萄球菌生物膜對(duì)人離體鼻竇黏膜溶菌酶，SLPI和gp340表達(dá)的影響
　　目的：
　　探討不同表型金黃色葡萄球菌對(duì)人離體鼻竇黏膜組織溶菌酶，SLPI和gp340表達(dá)的影響。
　　方法：

8、　　采集10例經(jīng)鼻內(nèi)鏡腦脊液鼻漏修補(bǔ)術(shù)患者的篩竇黏膜進(jìn)行離體組織培養(yǎng)并建立金黃色葡萄球菌游離菌和生物膜感染模型。以激光共聚顯微鏡確認(rèn)模型建立成功，分別在建模后8小時(shí)，16小時(shí)及24小時(shí)以ELISA法測(cè)定溶菌酶，SLPI和gp340分泌水平；24小時(shí)后以RT-PCR，免疫組化和Western blot法檢測(cè)培養(yǎng)組織中溶菌酶，SLPI和gp340的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果金黃色葡萄球菌游離菌和生物膜刺激溶菌酶，SLPI和gp340在離體

9、鼻黏膜組織模型中表達(dá)上調(diào)的水平不同；模型中溶菌酶，SLPI和gp340的分泌水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　金黃色葡萄球菌生物膜較游離菌更能誘導(dǎo)溶菌酶，SLPI和gp340在鼻竇黏膜組織中高表達(dá)，是影響宿主固有免疫的重要因素。
　　第三部分：溶菌酶，SLPI和gp340對(duì)體外金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜的作用
　　目的：
　　通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究溶菌酶，SLPI和gp340對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假

10、單胞菌生物膜的作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌參考株及臨床分離株，不同方法建立細(xì)菌生物膜體外模型。分別在細(xì)菌生物膜形成的不同階段用不同濃度的溶菌酶，SLPI和gp340進(jìn)行干預(yù)；以結(jié)晶紫染色，Baclight染色，alamarBlue檢測(cè)和激光共聚顯微鏡觀察分析干預(yù)效果。
　　結(jié)果：
　　溶菌酶，SLPI和gp340在體外對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌和生物膜有不同程度的殺傷作用