LAP+CD4+Treg細(xì)胞在結(jié)直腸癌患者外周血中的分布特征及體外研究.pdf

1、本文對LAP+CD4+Treg細(xì)胞在結(jié)直腸癌患者外周血中的分布特征進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：LAP+CD4+Treg細(xì)胞在結(jié)直腸癌患者外周血中的分布特征。
　　目的：檢測LAP+CD+Treg細(xì)胞在結(jié)直腸癌患者外周血中分布比例，并觀察其與腫瘤分期、病理類型之間的關(guān)系。
　　方法：選取40名結(jié)直腸癌患者與20名健康體檢志愿者作為研究對象。運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)對研究對象外周血LAP+CD+Treg細(xì)胞占C

2、D4+T細(xì)胞的比例進(jìn)行檢測。分析研究對象的相關(guān)臨床資料：性別、年齡、民族、術(shù)前癌胚抗原（Carcino-embryonic antigen，CEA)水平、腫瘤直徑、腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度等，初步探討結(jié)直腸癌患者外周血LAP+CD+Treg細(xì)胞比例分布與上述臨床資料間的關(guān)系。
　　結(jié)果：40例結(jié)直腸癌患者外周血LAP+CD4+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞（9.35?2.87）％，高于20例健康對照組（1.52?0.69）%，t＝

3、12.275，P＝0.000。有淋巴轉(zhuǎn)移的腸癌患者LAP+CD4+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞（11.41?2.02）%，明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移的腸癌患者（9.25?2.07）%，t＝3.276，P＝0.002。C、D期腸癌患者LAP+CD4+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞（10.77?1.99）%，A、B期腸癌患者LAP+CD4+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞（8.07?1.09）%，兩者之間差異顯著，t＝-5.376,P＝0.000。LAP

4、+CD4+Treg細(xì)胞在不同的性別、年齡、民族、腫瘤大小以及腫瘤分化程度的分組中無差異（P＞0.05）。根據(jù)Pearson相關(guān)分析顯示：腸癌患者外周血LAP+CD4+Treg細(xì)胞的比例與血清CEA水平呈正相關(guān)，r＝0.543，P＝0.006。
　　結(jié)論：結(jié)直腸癌患者外周血中LAP+CD+Treg細(xì)胞水平顯著高于健康對照組，提示其可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，具有作為機(jī)體免疫狀態(tài)指標(biāo)參考的潛能。LAP+CD+Treg細(xì)胞水平在淋

5、巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及不同腫瘤分期中存在差異，但尚不能認(rèn)為其與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。
　　第二部分：結(jié)直腸癌患者外周血LAP+CD4+Treg細(xì)胞的體外研究。
　　目的：通過體外分選結(jié)直腸癌患者外周血中的LAP+CD4+Treg細(xì)胞和LAP-CD4+T細(xì)胞，檢測并比較兩者細(xì)胞因子譜的差異，初步探討LAP+CD4+Treg細(xì)胞在結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制中的作用；同時(shí)觀察IL-8對LAP-CD4+T細(xì)胞體外誘導(dǎo)的影響。
　　方法：收集2014

6、年11月10日至2015年2月1日廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院初次行手術(shù)治療的32例結(jié)直腸癌患者的外周血，連續(xù)梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMCs），再用免疫磁珠分選技術(shù)（Magnetic Cell Sorting，MACS）分選出CD+T細(xì)胞中的LAP+CD4+Treg細(xì)胞和LAP-CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測分選后獲得的細(xì)胞純度；臺盼藍(lán)摻入法檢測分離前后細(xì)胞活性

7、，應(yīng)用液相芯片、酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent，ELISA）檢測兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清液所含相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-?、TGF-β的濃度。同時(shí)，將一定濃度IL-8添加到LAP-CD4+T細(xì)胞中培養(yǎng)72h，采用流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測相應(yīng)LAP-CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)孔中誘導(dǎo)獲得的LAP+CD4+Treg細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果：應(yīng)用磁珠免

8、疫法分選獲得的LAP+CD4+Treg細(xì)胞純度為（95.14±1.67）%，LAP-CD4+T細(xì)胞純度為（95.32±2.41）%；臺盼藍(lán)摻入法結(jié)果顯示LAP+CD4+Treg細(xì)胞存活率為（92.54±2.31）%，LAP-CD4+T細(xì)胞存活率為（93.14±2.35）%；液相芯片以及ELISA檢測結(jié)果表明LAP+CD4+Treg細(xì)胞較 LAP-CD4+T細(xì)胞分泌更高濃度IL-10、TGF-β（110.65±12.45 vs.72.86

9、±10.87，t=9.13，P=0.000；107.03±17.69 vs.64.19±14.15，t=7.76，P=0.000）。加入CD3、CD8抗體及IL-2可誘導(dǎo)活化的LAP-CD4+T細(xì)胞只產(chǎn)生部分LAP+CD4+Treg細(xì)胞（0.48?0.54）%，但在此基礎(chǔ)上添加IL-8后可產(chǎn)生更多的LAP+CD4+Treg細(xì)胞（1.51?0.26）%；t=6.379，P=0.000。
　　結(jié)論：磁珠免疫法分選獲得的LAP+CD4+