淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)直腸癌的臨床特征及荷瘤鼠CD8+記憶亞群研究.pdf

1、研究背景及研究目的:
　　免疫是指機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別自身與異己物質(zhì),并通過免疫應(yīng)答排除抗原性異物,以維持機(jī)體生理平衡的功能。而淋巴細(xì)胞則是免疫系統(tǒng)的重要組成部分,他可以通過直接或間接的方式來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,包括分泌細(xì)胞因子來改變機(jī)體的免疫狀態(tài)和腫瘤微環(huán)境、直接浸潤(rùn)到腫瘤組織中促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)等。眾所周知,浸潤(rùn)到腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞包括先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞,如樹突細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞和包括CD4+T和CD8+T細(xì)胞亞群

2、的T淋巴細(xì)胞[1]。Galon J et al.等研究表明表明,腫瘤組織中CD3+T細(xì)胞的密度是唯一的與病人的總生存相關(guān)聯(lián)的指標(biāo)[2]。然而, CD3+T細(xì)胞包括CD4+T細(xì)胞亞群和CD8+T細(xì)胞亞群,到底是哪個(gè)細(xì)胞亞群在這其中起主要作用還不是很清楚。除了對(duì)T細(xì)胞的探討,Julie S et a等研究表明,在高分化卵巢癌中,腫瘤浸潤(rùn)性CD20+B細(xì)胞(CD20+TIL)與患者的生存期有著緊密的聯(lián)系[3],在其他腫瘤中也如此,如乳腺癌[4

3、]和宮頸鱗狀細(xì)胞癌[5]。然而,CD20+TIL在結(jié)直腸癌中的作用尚不清楚[6]。所以在本研究中,我們通過免疫組化檢測(cè)結(jié)直腸癌組織芯片中CD4+,CD8+和CD20+ TIL在其瘤組織和癌旁組織中的浸潤(rùn)情況,然后分析這些淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)直腸癌患者中潛在的臨床意義。
　　研究方法:
　　1、制作結(jié)直腸癌組織芯片。
　　2、免疫組化檢測(cè)組織芯片中CD4+,CD8+和CD20+TIL在其瘤組織和癌旁組織中的浸潤(rùn)情況。

4、　　3、分析CD4+,CD8+和CD20+TIL與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1、從免疫組化可以看出,無論是在腫瘤組織還是在癌旁組織,CD4+,CD8+和CD20+TIL的浸潤(rùn)都可以很明顯的分為高浸潤(rùn)組和低浸潤(rùn)組。但是,相對(duì)于T細(xì)胞亞群來說, CD20+B細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量很少,特別是在腫瘤組織中。
　　2、統(tǒng)計(jì)分析表明,腫瘤組織中,浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞亞群的量與患者的年齡、瘤大小、N分類和腫瘤分期之間沒有任何關(guān)系

5、。然而在腫瘤組織中, T1和T2期的患者比T3和T4期的患者有更高密度的CD20+B細(xì)胞的浸潤(rùn)。此外,在癌旁組織中,M0期的患者比M1期的患者有更高密度的CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞和B細(xì)胞與結(jié)直腸癌的分期有一定的相關(guān)性。然而,考慮到CD4+T細(xì)胞的高異質(zhì)性,所以有必要進(jìn)一步研究浸潤(rùn)性CD4+T細(xì)胞亞群的作用。此外,研究CD20+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞潛在的抗腫瘤機(jī)制有著重要的

6、臨床意義。此研究將對(duì)結(jié)直腸癌病人制定更有效的免疫療法有很大的提示意義。
　　研究背景及研究目的:
　　我們的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中浸潤(rùn)的CD20+ B和CD8+ T細(xì)胞與腫瘤病人的病理參數(shù)有著一定的關(guān)系[1]。然而,眾所周知,參與抗腫瘤的T細(xì)胞主要是CD8+T淋巴細(xì)胞,而一系列的研究證明,初始CD8+T淋巴細(xì)胞在接受抗原刺激后會(huì)首先生成特異性的效應(yīng)CD8+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮其功能,而后這形成的90％-95%的特異性效應(yīng)CD8+T淋

7、巴細(xì)胞在抗原清除后都死亡[2],幾周之內(nèi),少量生存的特異性CD8+T淋巴細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步分化成高表達(dá)CD62L和CCR7的記憶細(xì)胞[3]。當(dāng)這群記憶細(xì)胞再次遭受相同抗原刺激時(shí),會(huì)表現(xiàn)為特異性的克隆增殖能力及強(qiáng)有力的清除抗原的能力[4]。也有研究表明,在抗原刺激后生成的特異性效應(yīng)細(xì)胞中有前體記憶CD8+T細(xì)胞的存在,只是不表現(xiàn)為記憶細(xì)胞的功能。在抗原清除幾周之后,這群抗原特異性的前體記憶CD8+T細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生改變,獲得了記憶細(xì)胞的功能

8、,即包括再次遭受抗原刺激時(shí)表現(xiàn)出的快速的增值能力、細(xì)胞殺傷能力及高分泌細(xì)胞因子的能力,同時(shí)這群抗原特異性的前體記憶CD8+T細(xì)胞的表面分子CCR7和CD62L的表達(dá)升高且細(xì)胞的生存能力都明顯增強(qiáng)[5]。這表明前體記憶CD8+T細(xì)胞是存在于早期免疫反應(yīng)中,只是在抗原清除后的幾周之內(nèi)才會(huì)形成有保護(hù)作用的記憶細(xì)胞,并且這些記憶細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞表面分子 CCR7和CD62L[1]。
　　CCR7和CD62L是淋巴細(xì)胞歸巢到脾臟、淋巴結(jié)等次級(jí)

9、淋巴器官的重要分子[2]。在早期的研究發(fā)現(xiàn),通過不同的歸巢分子,特別是CCR7和CD62L,可以區(qū)分至少兩種記憶CD8+T細(xì)胞亞群[3],但是這些記憶細(xì)胞的形成機(jī)制還不是很清楚,在決定哪些細(xì)胞變?yōu)橛洃浖?xì)胞而哪些細(xì)胞趨于死亡的這個(gè)過程還有待闡明,推測(cè)其最大的阻礙可能是缺少特異性的標(biāo)志來區(qū)分生存細(xì)胞和死亡細(xì)胞的發(fā)展過程[4]。記憶細(xì)胞是高表達(dá)IL-7受體α鏈(CD127)的,越來越多的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),無論是在動(dòng)物模型中還是在病人體內(nèi)[5],C

10、D127的表達(dá)對(duì) CD8+T細(xì)胞的記憶性的形成和成熟有著至關(guān)重要的作用[6]。已有研究表明,在效應(yīng) CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的高峰時(shí)期,有一小部分效應(yīng) CD8+T細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞表面分子CD127(IL-7Rα),且CD127的表達(dá)率與生成的記憶細(xì)胞的量成明顯正相關(guān)。因此推測(cè), CD127hiT細(xì)胞是前體記憶 T細(xì)胞[7]。并且將 CD127hi和CD127lo的T細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行ACT治療發(fā)現(xiàn),CD127hiT細(xì)胞有更強(qiáng)的保護(hù)機(jī)體的能力和成為長(zhǎng)

11、效記憶細(xì)胞T細(xì)胞的能力[8]。眾多研究表明,IL-7信號(hào)是記憶T細(xì)胞所必須的,這表明CD127的表達(dá)并不只是與記憶細(xì)胞的數(shù)量有關(guān),他還是記憶細(xì)胞的功能的形成所必須[9]。因此我們猜想,是否存在高表達(dá)CD127的同時(shí)也高表達(dá)CCR7或CD62L的一群CD8+T細(xì)胞,如果存在,這群細(xì)胞將有什么樣的功能,本文將以黑色素瘤小鼠為模型,就此問題進(jìn)行探討。
　　研究方法:
　　1、制備黑色素瘤小鼠模型,流式細(xì)胞儀檢測(cè)黑色素瘤小鼠和正常小

12、鼠的血液、脾臟和骨髓中表達(dá)CD8、CD62L、CCR7和CD127的各細(xì)胞亞群的比例,找出目的細(xì)胞亞群,即CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞亞群。
　　2、免疫組化(IHC)、免疫熒光(IF)及磁珠分選和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黑色素瘤組織中目的細(xì)胞群的浸潤(rùn)情況。
　　3、流式細(xì)胞儀分選目的細(xì)胞群,用MTT法檢測(cè)目的細(xì)胞群的增值情況、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)目的細(xì)胞群的凋亡情況及Q-PCR和ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ的分泌。
　

13、　4、將分選的目的細(xì)胞群用CFSE標(biāo)記后,回輸入黑色素瘤小鼠體內(nèi),檢測(cè)其目的細(xì)胞群在體內(nèi)的分布情況。
　　5、觀察分選出的目的細(xì)胞群在體內(nèi)的抗腫瘤效果。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、從黑色素瘤小鼠和正常小鼠的血液、脾臟和骨髓中分離出淋巴細(xì)胞,經(jīng)流式檢測(cè)顯示,與正常小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞相比,黑色素瘤荷瘤小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞中CD8+CCR7+T細(xì)胞、CD8+CD62L+T細(xì)胞、CD8+CD127+T細(xì)胞、CD8+CD62L+CD

14、127+T細(xì)胞、CD8+CD62L+CC7+T細(xì)胞、CD8+CCR7+CD127+T細(xì)胞和 CD8+CCR7+CD62L+CD127+T細(xì)胞的比例都發(fā)生了不同程度的改變。經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),在這些CD8+T細(xì)胞亞群中,黑色素瘤荷瘤小鼠脾臟中的CD8+CD127+T細(xì)胞、CD8+CD62L+T細(xì)胞和CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞的頻率顯著高于正常對(duì)照小鼠(P<0.05),但外周血和骨髓中的所有這些細(xì)胞的頻率在黑色素瘤荷瘤小鼠與正常

15、小鼠之間沒有顯著性差異。因很少有學(xué)者對(duì)CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞進(jìn)行研究,所以本研究以此細(xì)胞群作為目的細(xì)胞群進(jìn)行研究。
　　2、從組織化學(xué)(IHC)的結(jié)果可以得出,在黑色素瘤組織中,有明顯的 CD8+TIL的浸潤(rùn),且在癌旁成簇狀分布,在腫瘤組織中成散在分布。同時(shí),腫瘤組織的管腔中也有 CD8+TIL的浸潤(rùn)。免疫熒光雙染可以觀察到,腫瘤組織中有散在的CD8+CD127+TIL的分布。經(jīng)磁珠分選 CD8+TIL后用流式細(xì)胞

16、術(shù)檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞亞群,發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中有 CD8+CD62L+CD127+TIL細(xì)胞的存在,且比例占9%-10%左右。
　　3、MTT檢測(cè)顯示,將CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞與CD8+CD62L+CD127-T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞相比,CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞的增值能力明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示,CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞的凋亡能力比CD8+CD62L

17、+CD127-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的凋亡能力要弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用 Q-PCR檢測(cè) IFN-γ的 mRNA發(fā)現(xiàn),與 CD8+T細(xì)胞相比, CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞內(nèi) IFN-γ的 mRNA水平是顯著下降的(P<0.01),同時(shí)將CD8+CD62L+CD127-T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的mRNA水平與CD8+ T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的mRNA的水平進(jìn)行比較,CD8+CD62L+CD127-T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的m

18、RNA水平也是顯著降低的(P<0.05)。Elisa檢測(cè)其蛋白分泌情況,結(jié)果與mRNA的檢測(cè)結(jié)果是一致的。
　　4、將CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞群用CFSE標(biāo)記后回輸入黑色素瘤小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn),回輸?shù)募?xì)胞大多聚集在脾臟和淋巴結(jié)中,腫瘤組織中也有散在分布的回輸淋巴細(xì)胞的存在,而肝臟、腎臟則幾乎沒有觀察到回輸細(xì)胞的分布。
　　5、將分選出的CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在體外刺激培養(yǎng)后回輸入黑色

19、素瘤小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn) CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞的抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力比CD8+T細(xì)胞的抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1、黑色素瘤荷瘤小鼠脾臟中CD8+CD127+、CD8+CD62L+和CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞亞群的頻率顯著高于正常對(duì)照小鼠。提示這三個(gè)細(xì)胞亞群有可能參與了小鼠黑色素瘤的發(fā)生與發(fā)展。
　　2、黑色素瘤組織中能檢測(cè)到 CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),且 CD8+CD62L+CD1

20、27+T細(xì)胞亞群的比例可達(dá)到9%-10%左右,提示這增高的細(xì)胞亞群有可能直接參與了黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　3、與CD8+CD62L+CD127-T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞相比,CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞的增值能力增強(qiáng),但凋亡能力減弱,這可能是脾臟中CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞亞群比例升高的直接原因;與此同時(shí),CD8+CD62L+CD127+T細(xì)胞分泌 IFN-γ的能力是降低的,這與記憶細(xì)胞有著相似的特性。