肝臟癌前病變的發(fā)生機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 肝臟癌前病變的發(fā)生機(jī)制研究
　　研究目的:
　　世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)在1978年首次明確定義癌前病變(Precancerous Lesions)為“一種更容易發(fā)生惡性腫瘤的組織學(xué)改變”。癌前病變發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于其他組織，但并非所有的癌前病變均會(huì)進(jìn)展為惡性腫瘤。高級(jí)別不典型增生結(jié)節(jié)（High Grade Dyspla

2、stic Nodules，HGDN）是肝癌的癌前病變，HGDN是指“肝組織有異型增生但又未達(dá)到惡性腫瘤標(biāo)準(zhǔn)，具有高度惡性潛能的，直徑1mm以上的不典型增生結(jié)節(jié)”。HGDN是一種真正處于良惡性臨界狀態(tài)的肝組織，其進(jìn)展為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于其它非惡性結(jié)節(jié)，如增生性大結(jié)節(jié)(Large RegenerativeNodules，LRN)、低級(jí)別不典型增生結(jié)節(jié)(Low Grade Dysplastic Nodules，LGDN)等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，HGDN患

3、者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是LGDN的四倍，其五年內(nèi)進(jìn)展為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)60-80％。由此可知，HGDN是調(diào)控肝臟惡性腫瘤發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如果能有效控制甚至逆轉(zhuǎn)HGDN，那么就能大大降低肝癌的發(fā)病率。但是，目前與肝臟癌前病變相關(guān)的研究少之又少，其具體發(fā)生機(jī)制仍然鮮為人知。因此，我們希望通過(guò)對(duì)HGDN的形成，以及HGDN進(jìn)展為肝癌的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋找控制甚至逆轉(zhuǎn)HGDN的分子靶標(biāo)，以期最終能夠降低肝癌的發(fā)病率。
　　研究方法:

4、r>　　1.精準(zhǔn)獲取臨床HGDN組織樣本:運(yùn)用激光捕獲顯微切割技術(shù)(Laser CaptureMicrodissection，LCM)精準(zhǔn)割取同一患者肝臟石蠟樣本中的正常組織、HGDN組織和肝癌組織。
　　2.HGDN組織中microRNA表達(dá)譜鑒定:抽提LCM所獲取肝組織中的microRNA，利用microRNA低密度表達(dá)譜芯片檢測(cè)正常組織、HGDN組織和肝癌組織中的microRNA表達(dá)特點(diǎn);運(yùn)用microRNA動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)標(biāo)志物分

5、析技術(shù)(Dynamic Network BiomarkerAnalysis，DNB)篩選出HGDN中異常表達(dá)的microRNA。
　　3.研究目標(biāo)microRNA在正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的生物學(xué)功能:通過(guò)soft-agar克隆形成實(shí)驗(yàn)、皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)、retrorsine小鼠肝細(xì)胞原位移植實(shí)驗(yàn)、分選DEN誘癌小鼠原代HGDN細(xì)胞荷瘤實(shí)驗(yàn)、尾靜脈注射antagomir實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)等，深入研究目標(biāo)microRNA在肝細(xì)胞惡性

6、轉(zhuǎn)化過(guò)程中的相關(guān)功能。
　　4.構(gòu)建相關(guān)基因敲除小鼠并建立誘癌模型:我們構(gòu)建了miR-484組成型敲除小鼠(miR-484-/-)，并購(gòu)買了Ⅰ型干擾素受體組成型敲除小鼠（Ifnar1-/-）;通過(guò)對(duì)上述小鼠進(jìn)行DEN誘癌，進(jìn)一步研究miR-484和Ⅰ型干擾素信號(hào)通路在肝臟癌前病變形成和肝癌發(fā)生過(guò)程中的功能及意義。
　　5.機(jī)制探索:運(yùn)用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)、ChIP實(shí)驗(yàn)、相關(guān)抑制劑實(shí)驗(yàn)、基因敲除細(xì)

7、胞實(shí)驗(yàn)以及敲除小鼠體內(nèi)試驗(yàn)等，深入研究miR-484調(diào)控肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和HGDN形成的具體分子機(jī)制。
　　6.臨床印證:通過(guò)一系列的免疫組化實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)以及原位雜交實(shí)驗(yàn)，印證本研究中相關(guān)基因在臨床樣本和小鼠DEN誘癌樣本中的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.明確了肝臟癌前病變中microRNA的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)miR-449b，miR-545，miR-484，miR-320，miR-625#，miR-661和m

8、iR-29a#等在HGDN中異常高表達(dá)。
　　2.發(fā)現(xiàn)miR-484能誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)其成瘤能力。
　　3.DEN誘癌時(shí)下調(diào)miR-484能通過(guò)抑制癌前病變的形成影響肝癌的發(fā)生。
　　4.miR-484-/-小鼠DEN誘癌發(fā)現(xiàn)癌前病變的形成和肝癌的發(fā)生均顯著減少。
　　5.持續(xù)低劑量的Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)依賴于miR-484啟動(dòng)子區(qū)的H3K27高乙?；?H3K27Ac)作用，選擇性誘導(dǎo)miR-48

9、4表達(dá);而異常高表達(dá)的miR-484能進(jìn)一步誘導(dǎo)IFN-Ⅰ生成，形成一個(gè)正反饋環(huán)路，最終促進(jìn)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　6.Ifnar1-/-小鼠DEN誘癌后，20周時(shí)，敲除組肝中miR-484并未高表達(dá)，且其形成癌前病變明顯少于野生小鼠;40周時(shí)，其肝癌的大小和數(shù)量也顯著降低。
　　7.在臨床肝臟組織和血液樣本中，miR-484與IFN-Ⅰ表達(dá)量相關(guān)。
　　研究結(jié)論:
　　本研究首次明確了肝臟的癌前病變HGDN中mi

10、croRNA的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)了其中異常高表達(dá)的microRNA。我們?cè)趧?dòng)物水平和細(xì)胞水平證實(shí):肝臟的慢性炎癥或DNA損傷等誘導(dǎo)產(chǎn)生的低劑量Ⅰ型干擾素，依賴于miR-484啟動(dòng)子區(qū)H3K27Ac的作用，選擇性誘導(dǎo)miR-484生成;而異常高表達(dá)的miR-484又能誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的生成，形成了一個(gè)正反饋環(huán)路，最終誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝臟癌前病變的形成和腫瘤的發(fā)生。本研究首次發(fā)現(xiàn)低劑量的IFN-Ⅰ具有促進(jìn)HGDN形成和肝癌發(fā)生的作用，

11、相關(guān)結(jié)果為控制甚至逆轉(zhuǎn)肝臟的癌前病變HGDN提供了一些潛在的治療靶標(biāo)。
　　第二部分 CYP3A5在肝細(xì)胞癌中通過(guò)調(diào)控mTORC2/Akt信號(hào)通路發(fā)揮腫瘤抑制功能
　　研究目的:
　　細(xì)胞色素P450家族通過(guò)對(duì)內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的代謝在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中CYP3A亞家族的作用尤為顯著。CYP3A亞家族含量最多、底物譜很大，是代謝反應(yīng)中最主要的限速酶之一。CYP3A亞家族包括4個(gè)主要成員，即CYP3

12、A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。由于CYP3A7主要存在于胎肝，而CYP3A43最近才被發(fā)現(xiàn)，故這兩個(gè)成員的具體功能尚不明確;現(xiàn)今關(guān)于CYP3A亞家族研究最多的是它的兩個(gè)主要成員:CYP3A4和CYP3A5。其中，CYP3A4在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)功能已經(jīng)有較為充分的研究，它能活化前致癌物，且能參與抗腫瘤藥物的代謝;而CYP3A5是研究得最深入的CYP3A亞家族低豐度成員，但是相關(guān)研究仍主要集中于腫瘤發(fā)生和藥物代

13、謝這兩個(gè)方面，且相關(guān)研究主要是一些流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對(duì)CYP3A5在腫瘤發(fā)展過(guò)程中的具體生物學(xué)功能則缺乏深入研究。
　　研究方法:
　　1.利用網(wǎng)絡(luò)基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)CYP3A5在癌和癌旁的表達(dá)水平差異。
　　2.運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法分析CYP3A5原位表達(dá)差異，并根據(jù)組織芯片組化染色結(jié)果進(jìn)行CYP3A5與臨床-病理特征的相關(guān)性分析。
　　3.利用臨床肝癌標(biāo)本和不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系分析CYP3A5在

14、不同轉(zhuǎn)移能力肝癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平差異。
　　4.肝癌細(xì)胞株過(guò)表達(dá)CYP3A5后進(jìn)行遷移、侵襲、粘附等轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。
　　5.利用免疫印跡、siRNA、免疫共沉淀、酶譜分析、免疫組化染色等技術(shù)，深入研究CYP3A5調(diào)控肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1.CYP3A5的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌組織中顯著低于對(duì)應(yīng)癌旁組織。
　　2.CYP3A5表達(dá)水平的高低與肝癌轉(zhuǎn)移潛

15、能呈負(fù)性相關(guān)，且與預(yù)后直接相關(guān)。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)同時(shí)證明，過(guò)表達(dá)CYP3A5能明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和粘附能力。
　　4.CYP3A5通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路活性，調(diào)節(jié)TIMP1、TIMP2的表達(dá)和MMP2、MMP9的活性。
　　5.CYP3A5通過(guò)單純阻斷mTORC2激酶活性而非影響mTORC2復(fù)合物結(jié)構(gòu)，選擇性下調(diào)AKT的磷酸化水平(Ser473)。
　　6.CYP3A5通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)高水

16、平的ROS抑制mTORC2的激酶活性，進(jìn)而抑制AKT(Ser473)活化，最終影響肝癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)表型。
　　研究結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A5表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌組織中較癌旁組織明顯下調(diào)。我們運(yùn)用大樣本的肝細(xì)胞癌組織芯片驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，這種表達(dá)差異與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床和病理指標(biāo)存在顯著相關(guān)性，即CYP3A5表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)性相關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明過(guò)表達(dá)CYP3A5可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和粘附

17、能力，且這種轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的抑制作用主要是通過(guò)下調(diào)AKT信號(hào)通路活性，上調(diào)TIMP1、TIMP2表達(dá)水平和下調(diào)MMP2、MMP9的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)深入的實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)CYP3A5介導(dǎo)的AKT(Ser473)活化減弱是mTORC2/p-AKT(S473)途徑依賴的。同時(shí)，我們首次報(bào)道了CYP3A5通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生高水平的ROS，從而在不影響mTORC2復(fù)合物穩(wěn)定性的情況下單純抑制mTORC2的激酶活性，最終抑制了p-AKT所介導(dǎo)的肝細(xì)