TNF-α在圍生期大鼠肝內表達特征的初步研究.pdf

1、目的:
　　膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是引起新生兒阻塞性黃疸最常見的原因之一，其與自發(fā)性新生兒肝炎(INC)共占新生兒膽汁淤積性疾病的50％～70％。膽道閉鎖在亞洲人群中發(fā)病率約為1/8000，在歐洲人群中發(fā)病率約為1/18000，女嬰發(fā)病數量較多。其特征性病變是患兒在3個月內即出現全部或部分肝外膽管系統(tǒng)進行性纖維化閉塞，同時伴肝內膽管損傷及肝纖維化。臨床表現為阻塞性黃疸、白陶土大便、肝脾大三聯征，同時實驗室

2、檢查膽紅素及轉氨酶升高，且進展迅速。
　　膽道閉鎖病因未明，一般認為其發(fā)病機制涉及病毒感染、自身免疫介導的膽管破壞及膽道發(fā)育異常。20世紀90年以來，隨著研究深入，由圍生期病毒感染激發(fā)的免疫炎癥反應在BA的發(fā)生中起重要作用，尤其是病毒感染所引發(fā)的進行性纖維化病變是膽道閉鎖發(fā)生的重要原因之一。由病毒抗原激活的特異性T細胞通過γ干擾素（IFN-γ）刺激巨噬細胞釋放一氧化氮、氧代謝物質和腫瘤壞死因子（TNF），能特異性破壞膽管上皮細胞，

3、引起細胞壞死和凋亡，即使病毒被清除，膽管上皮細胞炎癥和損傷仍持續(xù)存在，并最終導致肝外膽管的纖維化和梗阻。
　　目前已有動物實驗研究證明，圍生期的小鼠經過腹腔內注射感染輪狀病毒可以形成類似于膽道閉鎖的動物模型，而在其他時間內感染并不會造成新生鼠膽汁淤積和膽道閉鎖發(fā)生，這可以說明圍生期的免疫系統(tǒng)發(fā)育具有一定的特殊性。
　　本研究擬對圍生期內巨噬細胞及其分泌的腫瘤壞死因子的表達情況進行分析，進一步了解這一特殊時期小鼠易患膽道閉鎖的

4、機制。
　　方法:
　　一、標本制備
　　Wistar孕鼠取孕17-21天(E17-21)的Wistar大鼠胎鼠及出生0-5天(N0-N5)的新生鼠，取出胎鼠及新生鼠的肝臟，其中E17、E19、N1、N3每組各取5個標本固定于4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成蠟塊。其余保存于-80℃冰箱中，用于Western blot及RT-PCR檢測。
　　二、實驗方法
　　1、Western blot

5、及RT-PCR:冰凍標本中提取總蛋白及總RNA，通過Westernblot及RT-PCR方法檢測各年齡組腫瘤壞死因子（TNF-α）及巨噬細胞特異性標記物F4/80在圍生期各個時間點的表達情況。
　　2、免疫組織化學方法:石蠟標本連續(xù)切片，厚度4μm，應用免疫組化方法染色分別檢測F4/80及TNF-α表達情況。采用NIS-Elements Basic Research多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)對F4/80及TNF-α表達進行觀察，并

6、分析判斷陽性細胞的總體趨勢。
　　三、數據分析
　　所有數據均用均數±標準差（(x)±s）表示，采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數值比較采用t檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　一、Western blot結果
　　TNF-α的蛋白量在E17-E20時水平較高，在出生前逐漸降低，中間略有波動，N0-N2時降至最低，之后又逐漸上升，N5時升至最高。F4/80的蛋白量變化與TNF-

7、α相似，同樣是出生前逐漸降低，在N0-N2時降至最低，后又逐漸上升，N5時達到最高。
　　二、RT-PCR結果
　　TNF-α mRNA水平在產前至N0水平相對較高，出生后迅速降低，N1-N4時降至最低，之后又逐漸上升。F4/80 mRNA的表達同樣在出生前逐漸下降，N0-N2時降至最低，之后又逐漸上升，N5時升至最高。
　　三、免疫組化染色結果
　　TNF-α的陽性表達的平均光密度在E19天（0.1724±0.

8、021）及N1天時（0.1656±0.017）表達較少，而在E17天（0.1938±0.025）及N3天（0.1952±0.021）時的陽性表達相對略多。巨噬細胞標記物F4/80同樣是在E19天（0.1891±0.018）及N1天時（0.1868±0.020）表達較少，而在E17天（0.1919±0.024）及N3天（0.1947±0.027）時的陽性表達相對略多。P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　TNF-α