骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)異體皮膚長(zhǎng)期存活的機(jī)理探索.pdf

1、背景：大面積的創(chuàng)傷需要大量健康組織修復(fù)缺損，自體組織往往無(wú)法彌補(bǔ)這樣的缺陷，異體復(fù)合組織的移植使得解決這個(gè)問(wèn)題成為了可能。但是異體復(fù)合組織移植仍面臨一些問(wèn)題，其中最為關(guān)鍵的是如何延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間，降低免疫抑制劑的毒副作用。
　　免疫耐受是指受體的免疫系統(tǒng)不再攻擊供體來(lái)源的組織。異體造血干細(xì)胞或骨髓移植的方法是公認(rèn)的誘導(dǎo)免疫耐受的重要方法。異體骨髓細(xì)胞中的供體來(lái)源的造血干細(xì)胞如果可以在受體骨髓腔內(nèi)定植，它們會(huì)在受體內(nèi)發(fā)育成熟為具

2、有正常免疫功能以及抗原提呈功能的細(xì)胞。接著，這些異體來(lái)源的細(xì)胞不會(huì)攻擊同一供體來(lái)源的細(xì)胞及組織器官，從而延長(zhǎng)異體移植物的存活時(shí)間，甚至免疫耐受狀態(tài)的建立。
　　異體骨髓移植仍存在著兩個(gè)問(wèn)題。第一，異體骨髓細(xì)胞仍可能誘發(fā)受體對(duì)其免疫排斥反應(yīng)，所以仍然需要大劑量的免疫抑制、照射等副作用較大的免疫誘導(dǎo)方案。第二，異體造血干細(xì)胞在受體體內(nèi)定植需要供體來(lái)源的骨髓微環(huán)境，而通過(guò)靜脈注射的方法，難以成功移植供體來(lái)源的造血干細(xì)胞微環(huán)境。
　

3、　骨髓腔內(nèi)注射可以提高異體造血干細(xì)胞的定植效率，延長(zhǎng)異體實(shí)體器官的存活時(shí)間，降低移植物抗宿主反應(yīng)的發(fā)生。雖然已經(jīng)有學(xué)者對(duì)于這一現(xiàn)象進(jìn)行了初步的探索，但是對(duì)于骨髓腔內(nèi)注射是否可以延長(zhǎng)異體皮膚的存活時(shí)間，誘導(dǎo)局部骨髓中微環(huán)境的改變?nèi)匀蝗狈μ剿?。這些研究對(duì)于異體骨髓移植中異體造血干細(xì)胞功能和局部骨髓免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)仍然缺乏深入的闡述。此外，局部照射聯(lián)合骨髓腔內(nèi)注射可否延長(zhǎng)異體皮片的存活時(shí)間，并降低免疫誘導(dǎo)方案對(duì)于受體的毒副作用呢？對(duì)于這些問(wèn)題的

4、探索有助于我們更好的改變局部骨髓微環(huán)境，促進(jìn)異體造血干細(xì)胞的定植并延長(zhǎng)異體皮片的存活時(shí)間，為促進(jìn)異體復(fù)合組織的長(zhǎng)期存活提供新的治療方案。目標(biāo)：1）探索骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞是否可以誘導(dǎo)異體皮片的長(zhǎng)期存活；2）探索骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞是否可以誘導(dǎo)局部骨髓中間質(zhì)微環(huán)境和免疫微環(huán)境改變，這些改變是否可以延長(zhǎng)異體皮膚的長(zhǎng)期存活；3）探索骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞聯(lián)合局部照射可否延長(zhǎng)異體皮片的長(zhǎng)期存活。
　　方法：
　　1)預(yù)處理

5、模型以及皮片移植的模型的建立：受體小鼠經(jīng)過(guò)4Gy X射線全身照射并給予骨髓腔內(nèi)注射供體來(lái)源的5×106的骨髓細(xì)胞。骨髓細(xì)胞移植后3周，受體接受同一供體來(lái)源1x1cm的鼠尾全厚皮片移植。待排斥終點(diǎn)，取材并進(jìn)行病理切片。
　　2)外周血嵌合體水平的測(cè)定：骨髓移植后1周、3周、12周、18周分別從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血，使用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)量供體細(xì)胞在外周血白細(xì)胞、粒細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞中的比例。
　　3)骨髓及脾臟中供體來(lái)源造血干細(xì)胞

6、、間質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例：分別在術(shù)后3周、12周測(cè)定受體注射側(cè)骨髓以及未注射側(cè)骨髓供體來(lái)源造血干細(xì)胞（H-2Kb+c-kit+sca-1+lineage-）、供體間質(zhì)細(xì)胞（H-2Kb+CD45-CD31-TER119-）、供體間質(zhì)干細(xì)胞（H-2Kb+CD45-CD31-TER119-PDGFR-α+）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+Foxp3+）比例。
　　4)測(cè)定骨髓及脾臟中細(xì)胞因子的表達(dá)：分別在術(shù)后3周、12周使用實(shí)時(shí)

7、定量PCR以及Western Blotting等測(cè)定骨髓和脾臟細(xì)胞中IL-2、IL-10、TGF-β等的表達(dá)水平。
　　5)手術(shù)去除局部注射骨髓：在異體骨髓移植后，分別在術(shù)后7天和21天手術(shù)去除局部注射脛骨，術(shù)后3周、12周測(cè)定外周血及脾臟中供體細(xì)胞比例，并測(cè)定脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，術(shù)后3周接受異體來(lái)源的皮片移植。
　　6)局部照射模型：使用3mm厚度的鉛板，并且修剪鉛板露出左側(cè)脛骨，給予局部脛骨30Gy的X射線照射。局部

8、照射后，通過(guò)病理切片觀察局部照射的效果。小鼠體重作為小鼠健康的指標(biāo)并進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。
　　7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用student t檢驗(yàn)進(jìn)行靜脈注射組、骨髓腔內(nèi)注射組、假手術(shù)組等兩兩之間的比較。使用配對(duì)t檢驗(yàn)比較注射側(cè)骨髓及對(duì)側(cè)骨髓的數(shù)據(jù)。Log-rank檢驗(yàn)方法用于分析生存曲線數(shù)據(jù)。P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1）骨髓腔內(nèi)注射可以較靜脈注射骨髓細(xì)胞延長(zhǎng)異體皮片存活時(shí)間，并且誘導(dǎo)各系細(xì)胞的嵌合體水平增

9、高。骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞可以較靜脈注射和假手術(shù)組延長(zhǎng)異體皮片的存活時(shí)間（中位存活時(shí)間：骨髓腔內(nèi)注射組，60天；假手術(shù)組，32.5天；靜脈注射組，29.5天）并升高外周血中B細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞中供體細(xì)胞的水平，尤其升高了早期外周血中供體來(lái)源粒細(xì)胞水平。
　　2）骨髓腔內(nèi)注射主要改變了局部注射骨髓的間質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境。相較于靜脈注射組和假手術(shù)組，骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞可以將大多數(shù)局部注射骨髓的受體來(lái)源間質(zhì)細(xì)胞替換為供體來(lái)源的細(xì)胞（

10、術(shù)后12周，注射側(cè)骨髓76.2％，未注射側(cè)骨髓33.3%，P＜0.05），并提高了局部注射骨髓中間質(zhì)干細(xì)胞的比例。
　　3）骨髓腔內(nèi)注射可以升高局部注射骨髓中受體來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。相較于未注射骨髓，骨髓腔內(nèi)注射可以在早期（術(shù)后3周）升高局部注射骨髓中受體來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，而在晚期這種差異逐漸消失。同時(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的升高還伴有IL-10等細(xì)胞因子表達(dá)的升高，而TGF-β、IL-2等卻沒(méi)有升高。
　　4）早期（

11、術(shù)后7天）去除局部注射骨髓可以使得供體來(lái)源細(xì)胞比例降低。在術(shù)后7天而非21天去除局部注射骨髓，可以使得供體來(lái)源細(xì)胞及造血干細(xì)胞的比例明顯降低，但是還不足以影響供體皮片的存活時(shí)間。
　　5）局部照射聯(lián)合免疫抑制劑及骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞可以提高外周血中供體細(xì)胞的比例，但是不足以誘導(dǎo)免疫耐受或者延長(zhǎng)異體皮片的存活時(shí)間。局部照射（30 Gy X射線）聯(lián)合免疫抑制劑（腹腔注射雷帕霉素2mg/kg/天14天）及骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞可以

12、顯著提高外周血中供體細(xì)胞的比例，并一定程度延長(zhǎng)異體皮片的存活時(shí)間，但兩組之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6）局部創(chuàng)傷的作用不足以改變局部骨髓的微環(huán)境。在以上的實(shí)驗(yàn)中，局部注射PBS并沒(méi)有導(dǎo)致局部注射骨髓與假手術(shù)組之間出現(xiàn)明顯供體細(xì)胞比例、造血干細(xì)胞比例、間質(zhì)細(xì)胞比例、間質(zhì)干細(xì)胞比例、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子的變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。
　　結(jié)論：
　　我們的研究中有以下發(fā)現(xiàn)：
　　1）在本實(shí)驗(yàn)室建立了骨髓腔內(nèi)注射聯(lián)合

13、非致死劑量的全身照射延長(zhǎng)異體皮片長(zhǎng)期存活的小鼠模型，并證實(shí)了骨髓腔內(nèi)注射可以較靜脈注射延長(zhǎng)異體皮片的存活時(shí)間。
　　2）本研究首次證實(shí)了骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞可以替換局部注射骨髓的間質(zhì)微環(huán)境并且升高局部注射骨髓中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及免疫抑制相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　3）骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細(xì)胞可以早期（7天）促進(jìn)異體造血干細(xì)胞在受體局部注射骨髓中定植，但是這種作用在術(shù)后21天消失。
　　4）我們首次試圖使用聯(lián)合局部照射以及