shRNA介導IGF-IR基因沉默抑制鼠心肌肥厚的體內外實驗研究.pdf

1、目的:
　　評價磁性納米顆粒作為基因載體介導小發(fā)夾結構RNA(shRNA)靶向沉默IGF1R對去甲腎上腺素誘導的鼠心肌肥厚的抑制作用及其可能的機制。
　　方法:
　　檢索IGF-1R的基因序列，依照此序列構建同時表達綠色熒光蛋白基因(GFP)和特異性針對小鼠心肌細胞胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)基因的shRNA的質粒pGFPshIGF-1R，共設計了兩條序列，用聚合物作為載體，將質粒pGFPshlGF-1R轉

2、染進鼠心肌細胞，篩選轉染效率較高的基因序列;根據上述篩選的質粒，轉染體外培養(yǎng)的鼠心肌細胞，同時與單純的脂質體轉染方法相比較，通過western blot檢測兩種轉染方法對平滑肌細胞中IGF-1R蛋白表達下調情況;外加磁場作用，篩選轉染效率最高的磁場參數。在去甲腎上腺素誘導的鼠心肌肥厚細胞及動物模型中，通過心重/體重比、心肌橫截面積、心超檢測左室大小及心功能等評價心肌肥厚模型建立情況。轉染質粒pGFPshlGF-1R與聚合物的復合物，分子

3、水平用westernblot檢測聚合物載體體內轉染24h、48h、72h后，組織中IGF-1R蛋白表達受抑情況;注射結束后1周，再次通過心重/體重比、心肌橫截面積、心超檢測左室大小及心功能等評價聚合物質粒pGFPshlGF-1R體內抑制心肌肥厚程度，并探索IGF1R下游信號通路蛋白活化情況。
　　結果:
　　首先通過測序驗證了RNA干擾序列成功插入質粒內，經過western blot和RT-PCR檢測IGF1R表達，篩選出序

4、列2為抑制效率較高的序列，對心肌肌細胞IGF-1R在mRNA水平和蛋白水平的抑制率分別達到47％±1.8％，和41％±1.2％。在轉染載體篩選方面，不論脂質體轉染還是應用聚合物轉染方式，都可以將質粒pGFPshlGF-1R轉染進心肌細胞內。相對于空白對照組和脂質體轉染，聚合物作為載體展現了較高的效率。流式細胞結果表明，綠色熒光蛋白基因(GFP)陽性的細胞數占35.1±3.1％，而在脂質體轉染組綠色熒光蛋白基因(GFP)陽性的細胞數只有1

5、3.0±5.1％;協同磁場轉染，在250mT輻照15min的條件下轉染效率最高，可以達到58％左右。在心肌肥厚模型的構建上，通過去甲腎上腺素成功誘導心肌細胞和小鼠心臟肥厚的模型，并檢測出IGF1R明顯增高、ANP及β-MHC的mRNA表達也明顯增高。在體內轉染條件的實驗中，經尾靜脈注射表達IGF1R shRNA的聚合物，能有效到達心肌組織，轉染24h、48h、72h均能明顯抑制IGF1R表達，顯著減少去甲腎上腺素誘導的心肌肥厚，改善心功