番茄果實中miRNA的克隆及表達水平鑒定.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類長約20-25個堿基的小分子非編碼RNA,它們廣泛的存在于真核生物中,許多研究證明,這些microRNA在生物體內(nèi)有著非常重要的調(diào)節(jié)功能,幾乎涉及到了所有的細(xì)胞水平方面的功能。microRNA作為一種真核生物體內(nèi)的重要的調(diào)節(jié)因子,近年來在動物和植物中被廣泛研究。隨著實驗方法和生物信息學(xué)方法的進步,越來越多的miRNA被克隆出來,但是在各個物種中所鑒定的microRNA的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及其理論上的飽和值

2、,所以對microRNA的分離鑒定依然是對microRNA研究的一個熱點方向。正如擬南芥是分子生物學(xué)的模型植物,番茄是果實生長發(fā)育及成熟的模型,對番茄miRNA的研究可以發(fā)現(xiàn)對成熟有調(diào)控作用的miRNA。這些miRNA可被用來通過基因工程的手段改良果實的品質(zhì)(營養(yǎng)和風(fēng)味)、提高產(chǎn)量和延長保鮮期,或者以其作分子標(biāo)記輔助常規(guī)育種選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種。本研究用番茄的果實做材料,采用氛氯仿抽提的方法提取總RNA,用聚乙醇8000沉淀的方法得到小RN

3、A(≦200nt),采用20bp和40bp的DNA引物做Mark,用聚丙烯酰胺凝膠分離到20～40bp的小RNA,在它們的3’端加Poly(A)尾巴、5’端加RNA接頭(5’-CGACUGGAGCGACACUGACA UGGACUGAAGGAGUAGAA-3’),然后通過RT-PCR擴增,將PCR產(chǎn)物連接到T載體,對陽性克隆測序,共獲得了50多個小RNA序列,在番茄基因的數(shù)據(jù)庫中查找它們的同源序列,得到4個候選miRNA,對它們進行二級