T-LAK細(xì)胞來源的蛋白激酶(TOPK)在食管鱗癌增殖中的功能研究.pdf

1、食管癌是我國癌癥的第四大死因，其死亡率高，預(yù)后差。目前食管癌治療的基本方法是手術(shù)結(jié)合放化療，但治療效果仍然有限，食管癌患者的五年生存率僅為17％，低于我國腫瘤患者五年生存率的中位數(shù)。食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不完全明確，因而必須深入了解食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，才能制定有效的治療方案，進(jìn)而降低食管癌的死亡率和發(fā)生率。食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是我國食管癌的主要類型，其發(fā)生發(fā)展過

2、程與多個信號通路的異常激活有關(guān)。因此，篩選新的治療靶點并制定有效的治療方案是食管鱗癌臨床亟待解決的問題之一。
　　癌癥基因譜研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌中存在79個促進(jìn)ESCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，這些基因涉及基因組穩(wěn)定、細(xì)胞存活和細(xì)胞生存的12個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，近期研究證實AKT、RAS等多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常是促進(jìn)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的因素之一，并參與ESCC的增殖、轉(zhuǎn)移、分化等多個過程。因此，闡明食管鱗癌中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制，篩選信號通路的關(guān)

3、鍵靶點及其抑制劑，可以為阻斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展制定有效的治療方案，為提高ESCC患者生存率提供理論支持。
　　T-LAK細(xì)胞來源的蛋白激酶(T-LAK cell-originated Protein kinase，TOPK)，是一種新發(fā)現(xiàn)的絲-蘇氨酸激酶，屬于MAPKK分子家族，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示它是MEK1/2和MKK7之間的分支，其參與多種生物學(xué)過程，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及炎癥等過程。TOPK的活化是有絲

4、分裂早期的重要步驟，TOPK和cdk1/cyclin B1復(fù)合體結(jié)合，使胞質(zhì)分裂蛋白1磷酸化，從而促使細(xì)胞分裂，從而加速細(xì)胞G2/M期進(jìn)程促進(jìn)細(xì)胞的增殖。TOPK激酶甚至可以和腫瘤抑制基因p53的DCD結(jié)構(gòu)域相結(jié)合從而阻斷p53的作用，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白如p21的表達(dá)。近來研究還發(fā)現(xiàn)Cdk1激活調(diào)控的TOPK激酶活化后，可以瞬時調(diào)節(jié)在細(xì)胞分裂中的多種DNA連接蛋白，并且可以在幾分鐘內(nèi)調(diào)控這些蛋白的前體。C2H2鋅指蛋白就是這一大類保守蛋白

5、，其包含有多個鋅指結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)域，TOPK激酶是首個證實在有絲分裂中可以和這些保守區(qū)域結(jié)合進(jìn)而調(diào)控整個轉(zhuǎn)錄因子的蛋白激酶。TOPK在白血病、淋巴瘤、乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌、肺癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且和腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。TOPK在這些不同的腫瘤中通過激活不同的信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，甚至還參與了腫瘤耐藥的形成，降低了腫瘤治療的有效性。替普瑞酮和甲羥戊酸治療抵抗的乳腺癌患者中，Yes相關(guān)蛋白(Yes-assoc

6、iated protein,YAP)誘導(dǎo)的TOPK蛋白表達(dá)增加對促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖起到了重要作用。此外，報道TOPK激酶通過直接磷酸化c-Jun S73和S63促進(jìn)肺癌細(xì)胞對EGFR抑制劑吉非替尼耐藥性的產(chǎn)生。這些研究表明TOPK有可能成為腫瘤治療的有效治療靶點。
　　然而，TOPK在食管鱗癌中的功能及其機(jī)制尚沒有文獻(xiàn)報道，因此，進(jìn)一步研究TOPK在食管鱗癌中的功能及其機(jī)制可以為TOPK成為食管鱗癌的治療靶點提供理論依據(jù)。本課題通

7、過三個部分來研究TOPK在食管鱗癌中的功能及其機(jī)制，利用食管癌組織芯片檢測TOPK在食管鱗癌中的表達(dá)水平，評價TOPK與食管鱗癌病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性；采用慢病毒載體、轉(zhuǎn)染、篩選出TOPK低表達(dá)細(xì)胞系，和TOPK抑制劑HI-TOPK-032這2種方法評價TOPK下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響；進(jìn)而通過激酶芯片技術(shù)探討TOPK下調(diào)后引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變，將表面等離子共振技術(shù)(surface plasma resonance techn

8、ology，SPR)和質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)聯(lián)用篩選出TOPK激酶磷酸化的作用靶點Y盒子結(jié)合蛋白1（Y box protein1,YB1），MS篩選發(fā)現(xiàn)TOPK磷酸化YB1的位點Thr89和Ser209;以siRNA下調(diào)YB1的表達(dá)觀察YB1在食管鱗癌細(xì)胞中的作用及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變；使用TOPK敲低穩(wěn)定表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞系裸鼠移植瘤模型和構(gòu)建的食管鱗癌患者來源的移植瘤（patient-derived x

9、enograft，PDX）模型評價以TOPK為靶點在體內(nèi)抑制食管鱗癌移植瘤生長的效果，為TOPK作為食管鱗癌患者靶向治療的新靶標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　第一部分 TOPK在人食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床相關(guān)性評價方法：
　　1、以癌旁組織為對照，免疫組化方法檢測組織芯片中100例食管鱗癌TOPK的表達(dá)。
　　2、統(tǒng)計分析TOPK與食管鱗癌患者臨床病理特征（性別、年齡、分化和腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的相關(guān)性，評價TOPK的表達(dá)與食

10、管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、與食管鱗癌癌旁組織相比，TOPK在食管鱗癌中高表達(dá)
　　TOPK陽性表達(dá)主要于細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核，呈不同強(qiáng)度棕黃色染色。根據(jù)score值不同分為低表達(dá)組(Score≤3)和高表達(dá)組(Score>3)，100例病人中TOPK高表達(dá)66例，低表達(dá)34例,而癌旁正常組織中為陰性表達(dá)。
　　2、TOPK的表達(dá)與食管鱗癌患者病理特征的相關(guān)性
　　將TOPK的表達(dá)按照食管鱗癌

11、臨床資料(年齡，性別，分化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管鱗癌病人中TOPK低表達(dá)為21例，占43.48%，高表達(dá)為25例，占56.52%，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管鱗癌病人中TOPK低表達(dá)13例，占25.93%，高表達(dá)41例，占74.07%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，X2=5.154，P=0.023。而TOPK的表達(dá)和食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤的分化、腫瘤浸潤程度沒有相關(guān)性(P>0.05)。
　　3、TO

12、PK高表達(dá)預(yù)示食管鱗癌患者生存期短，預(yù)后差
　　100例食管鱗癌患者中，TOPK高表達(dá)組患者為66例，存活期為19.82±2.03月；TOPK低表達(dá)組食管鱗癌患者為34例，生存期為49.75±5.89月，P<0.001。將食管鱗癌患者的生存期和TOPK的表達(dá)采用Kaplan-meier法進(jìn)行存活相關(guān)性分析，經(jīng)Log Rank統(tǒng)計檢驗，Cox多因素回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TOPK的高表達(dá)與食管鱗癌患者生存期具有相關(guān)性（P<0.001）。<

13、br>　　第二部分下調(diào)TOPK抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖及其分子機(jī)制研究
　　第一章下調(diào)TOPK對食管鱗癌細(xì)胞EC9706和TE13增殖的抑制作用
　　方法：
　　1、Western Blotting篩選食管鱗癌細(xì)胞系中TOPK表達(dá)情況。
　　2、慢病毒轉(zhuǎn)染建立食管鱗癌細(xì)胞EC9706和TE13TOPK敲低穩(wěn)定細(xì)胞系，Western Blotting評價轉(zhuǎn)染效率。
　　3、CCK8實驗和軟瓊脂集落形成實驗評價T

14、OPK敲低后對食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成的抑制作用。
　　4、CCK8實驗和軟瓊脂集落形成實驗評價TOPK抑制劑HI-TOPK-032對食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1、TOPK在食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)和TOPK敲低穩(wěn)定細(xì)胞系的建立
　　TOPK在TE1、TE13、EC9706和EC1細(xì)胞系中呈高表達(dá)。通過慢病毒轉(zhuǎn)染、篩選建立TOPK敲

15、低穩(wěn)定細(xì)胞系EC9706 shTOPK#1和EC9706 shTOPK#2，TE13 shTOPK#1和TE13 shTOPK#2細(xì)胞系，其TOPK的表達(dá)相比對照組shMock明顯下調(diào)。
　　2、敲低TOPK后抑制食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成
　　CCK8實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在EC9706和TE13細(xì)胞中敲低TOPK明顯抑制細(xì)胞增殖；軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在EC9706和TE1

16、3細(xì)胞中敲低TOPK明顯抑制克隆形成。
　　3、TOPK抑制劑HI-TOPK-032抑制食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成
　　CCK8實驗和軟瓊脂集落形成實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，HI-TOPK-032明顯抑制EC9706和TE13細(xì)胞的增殖和克隆形成。
　　第二章下調(diào)TOPK抑制食管鱗癌細(xì)胞系中信號通路的激活
　　方法：
　　1、利用蛋白激酶芯片檢測TOPK敲低對EC9706細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

17、通路的影響
　　2、Western blotting方法驗證TOPK敲低后EC9706和TE13的信號通路的改變
　　3、Western blotting方法檢測HI-TOPK-032作用24h后對EC9706和TE13的信號通路的改變
　　結(jié)果:
　　1、蛋白激酶芯片檢測TOPK敲低對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　芯片結(jié)果顯示:和對照shMock組相比，Akt1/2/3 S473在EC9706shTOPK#1和

18、EC9706shTOPK#2分別下降至0.33和0.49倍；Akt1/2/3 T308分別下降至0.85和0.51倍；p70S6kinase T421/S424分別下降至0.57和0.23倍；ERK1/2 T202/Y204分別下降至0.81和0.79倍。
　　2、Western blotting法驗證蛋白激酶芯片結(jié)果
　　EC9706和TE13中敲低TOPK或HI-TOPK-032作用均可抑制AKT/mTOR/p70S6K

19、和ERK信號通路的激活，該結(jié)果和蛋白激酶芯片結(jié)果一致。
　　第三章 TOPK下游分子靶點的研究
　　方法:
　　1、通過表面等離子共振技術(shù)篩選TOPK激酶在EC9706細(xì)胞中的作用靶點，結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果和驗證，推測出Y盒子結(jié)合蛋白1（Y-box binding protein1，YB1）是TOPK下游靶點之一。
　　2免疫組化觀察TOPK和YB1在食管鱗癌組織中的共定位，細(xì)胞免疫熒光方法觀察TOPK和YB1在食管

20、鱗癌細(xì)胞EC9706和TE13中的共定位。
　　3、免疫沉淀方法檢測外源性和內(nèi)源性TOPK和YB1的結(jié)合情況。
　　4、體外激酶檢測TOPK激酶能否磷酸化YB1，質(zhì)譜分析TOPK激酶磷酸化YB1的具體位點。
　　結(jié)果:
　　1、SPR和MS技術(shù)聯(lián)用篩選在EC9706中與TOPK激酶結(jié)合的蛋白
　　SPR獲得的EC9706蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，將GST-TOPK蛋白、TOPK激酶組和對照組進(jìn)行比較，選取Score

21、值大于25的蛋白。我們重點分析與TOPK激酶結(jié)合的32個蛋白，經(jīng)過二級質(zhì)譜確定，我們選定YB1作為下一步研究的對象,推測TOPK激酶激活YB1進(jìn)而參與TOPK激酶下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。
　　2、TOPK與YB1在食管鱗癌組織和食管鱗癌細(xì)胞中共定位
　　免疫組化結(jié)果顯示YB1和TOPK在食管鱗癌組織中能夠同時出現(xiàn)在細(xì)胞漿內(nèi)，免疫熒光結(jié)果顯示，食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13里，TOPK與YB1能夠同時出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)中。說明

22、TOPK與YB1在食管鱗癌細(xì)胞中能夠共定位。3內(nèi)外源性TOPK與YB1可以相互結(jié)合
　　通過免疫共沉淀證實HEK293細(xì)胞里過表達(dá)的TOPK和過表達(dá)的YB1相互結(jié)合,證實HEK293細(xì)胞中外源性TOPK能與YB1結(jié)合;EC9706細(xì)胞中YB1能夠被TOPK抗體特異性地下拉，證實EC9706細(xì)胞中內(nèi)源性TOPK能與YB1結(jié)合。
　　4、TOPK在體外磷酸化YB1蛋白的Thr89和Ser209
　　體外激酶實驗證實TOPK

23、激酶能夠在體外磷酸化YB1；擴(kuò)大體外激酶樣本量，通過質(zhì)譜篩選到證實體外TOPK磷酸化YB1的兩個磷酸化位點是Thr89和Ser209。
　　第四章 YB1在食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13細(xì)胞增殖中的作用
　　方法:
　　1、采用Western Blotting方法檢測多個食管鱗癌細(xì)胞系中YB1的表達(dá)。
　　2、通過siRNA干擾食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13細(xì)胞中YB1的表達(dá)，進(jìn)一步以CCK8和軟瓊脂

24、集落形成實驗評價YB1下調(diào)對EC9706和TE13細(xì)胞增殖和克隆形成的影響。
　　3、Western Blotting法檢測通過siRNA干擾YB1下調(diào)后對TOPK，p-TOPK及AKT/mTOR/p70S6K和ERK信號通路的影響。
　　結(jié)果:
　　1、YB1在食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　為了評價YB1在食管鱗癌中的表達(dá)，我們檢測了多個食管鱗癌細(xì)胞系中YB1的表達(dá)，結(jié)果顯示YB1在多個食管鱗癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)不同

25、程度表達(dá)，提示YB1的高表達(dá)和食管鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)特性相關(guān)。
　　2、下調(diào)YB1抑制食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的生長和克隆形成
　　siRNA結(jié)果顯示YB1在食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13中的表達(dá)明顯降低，CCK8實驗和軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示下調(diào)YB1的表達(dá)可以抑制EC9706和TE13細(xì)胞的增殖和克隆形成。
　　3、下調(diào)YB1對食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13中p-TOPK和TOPK的表達(dá)無影

26、響，而抑制AKT/mTOR/p70S6K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活
　　Western blotting結(jié)果證實，在EC9706和TE13細(xì)胞中，下調(diào)YB1對p-TOPK和TOPK的表達(dá)并無影響，卻明顯抑制AKT/mTOR/p70S6K信號通路的活化，對ERK通路影響較小。
　　第三部分下調(diào)TOPK對EC9706細(xì)胞移植瘤和人食管鱗癌組織來源的移植瘤生長的抑制作用
　　第一章 TOPK下調(diào)抑制食管鱗癌細(xì)胞生長
　　方法:

27、
　　1、構(gòu)建EC9706shMock、EC9706 shTOPK#1和EC9706shTOPK#2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，通過測量腫瘤體積大小，小鼠體重、飲食飲水來評價TOPK敲低后在體內(nèi)對食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響。
　　2、通過免疫組化評價裸鼠移植瘤模型中增殖相關(guān)蛋白Ki67、TOPK和p-TOPK及TOPK下游信號通路的變化。
　　結(jié)果:
　　1、裸鼠移植瘤生長期間移植瘤體積、小鼠體重、飲食和飲水的改變情況

28、>　　皮下注射細(xì)胞后第7d開始測量腫瘤體積，第13d即可觀察到實驗組與對照明顯差異；生長期間實驗組小鼠體重、飲食和飲水和對照組無差異。
　　2、實驗結(jié)束時各組移植瘤體積、質(zhì)量的情況
　　第21d處死小鼠，測量各組移植瘤體積，并稱量各組移植瘤質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，EC9706shTOPK#1和EC9706shTOPK#2組瘤體積和質(zhì)量均減少（P<0.001）。
　　3、免疫組化檢測移植瘤中信號通路的激活情況

29、　　免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，移植瘤中EC9706shTOPK#1和shTOPK#2組中TOPK、p-TOPK、Ki67和AKT、mTOR和p70S6K磷酸化水平下降（P<0.05）。
　　第二章構(gòu)建人食管鱗癌組織來源的移植瘤模型
　　方法:
　　1、通過收集人食管鱗癌患者手術(shù)標(biāo)本26例，皮下移植入重度聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠，生長，傳代。

30、>　　2、通過繪制移植瘤生長曲線、HE染色和CK5/6、p40、p60的免疫組化評價評價構(gòu)建的PDX模型。
　　結(jié)果:
　　1、食管鱗癌病人臨床資料
　　2、6個病例中，14例病人成功建立PDX模型，成功率為53.8%。26個病人中17個男性，9個女性，年齡范圍為46-82歲，II期17人，III期3人，II-III期2人，I期3人，I-II期1人。
　　2、ESCC PDX移植瘤的生長曲線、病理學(xué)評價及免疫組化

31、分析
　　從建立的14例ESCC PDX移植瘤模型中，選取EG2，EG3和EG5三例為代表，生長曲線結(jié)果顯示第三代腫瘤生長時間較前兩代縮短；HE病理和CK5/6、p40、p63免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植瘤組織病理類型和3個指標(biāo)陽性表達(dá)與原代病人腫瘤組織一致。
　　第三章 HI-TOPK-032抑制人食管癌組織來源的移植瘤模型的生長
　　方法:
　　1、用Western blotting方法從構(gòu)建成的ESCC PDX模型

32、中篩選出p-TOPK陽性（EG5）和陰性（EG2）表達(dá)的移植瘤模型為對象，用TOPK抑制劑HI-TOPK-032分別對EG5和EG2兩例移植瘤進(jìn)行治療，通過測量兩例移植瘤體積大小，小鼠體重、飲食飲水來評價TOPK抑制劑HI-TOPK-032對人食管鱗癌組織生長的影響。
　　2、通過免疫組化評價HI-TOPK-032治療的兩組ESCC PDX模型移植瘤中p-TOPK、p-AKT473、p-mTOR，p-p70S6K等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白

33、及細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67的變化。
　　結(jié)果:
　　1、病人的臨床資料
　　p-TOPK陽性病例EG5和p-TOPK陰性病例EG2均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，食管鱗癌手術(shù)前均沒有進(jìn)行放化療。EG2和EG5的病人均為食管鱗癌，男性，年齡分別為64歲和61歲，分化類型分別為中高分化和中分化，二者分期均為IIa(T2N0M0)期，均無遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
　　2、HI-TOPK-032治療期間的小鼠移植瘤的體積、體重、飲食和飲

34、水的改變情況
　　EG5移植瘤從給藥第12天起，給藥組比對照組移植瘤體積減少，P=0.002。而EG2移植瘤給藥過程中給藥組比對照組移植瘤體積未見到明顯差異。每周兩次稱量EG5和EG2組小鼠體重、飲食、飲水發(fā)現(xiàn)給藥組和溶劑對照組的沒有差異，P>0.05。
　　3、實驗結(jié)束時各組小鼠移植瘤體積、質(zhì)量的情況
　　實驗在第29天終止，EG5治療組瘤體積與對照組相比明顯減小(P=0.001)。而EG2移植瘤體積對照組和治療組差

35、異不明顯，P>0.05。EG5治療組瘤質(zhì)量與對照組明顯減少，P=0.004；而EG2移植瘤質(zhì)量治療組和對照組差異不明顯，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。
　　4、免疫組化檢測PDX模型中信號通路蛋白磷酸化的改變情況
　　經(jīng)HI-TOPK-032治療的TOPK陽性EG5組移植瘤組織EG5中p-TOPK、p-AKT473、p-mTOR，p-p70S6K等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白及細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0

36、.05。而在TOPK陰性的EG2組人食管鱗癌移植瘤組織中各指標(biāo)改變不明顯，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。
　　全文結(jié)論
　　1、TOPK在食管鱗癌中的表達(dá)比癌旁正常組織增高，和食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，和食管鱗癌病人預(yù)后呈相關(guān)，而與食管鱗癌病人的其他臨床特征（性別、年齡、分化和腫瘤浸潤）無關(guān)。
　　2、降低TOPK的表達(dá)可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和食管鱗癌移植瘤的生長，提示TOPK在食管鱗癌增殖中發(fā)揮重要作用

37、，TOPK有望成為食管鱗癌預(yù)防和治療的重要分子靶標(biāo)。
　　3、降低TOPK的表達(dá)可以抑制AKT/mTOR/p70S6K和ERK信號通路的激活，TOPK激酶在Thr89和Ser209位點磷酸化YB1，下調(diào)YB1可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和AKT/mTOR/p70S6K信號通路的激活，提示TOPK磷酸化YB1進(jìn)而激活A(yù)KT/mTOR/p70S6K信號通路是TOPK促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。
　　4、成功構(gòu)建人食管鱗癌組織來