2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分 Ps1及Ps1-shRNA重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果的研究
  目的:構(gòu)建心肌靶向性Ps1及Ps1-shRNA重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV9-Ps1,rAAV9-Ps1-shRNA),并對其體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行研究。方法:針對大鼠心肌組織中Ps1基因設(shè)計3條心肌特異性shRNA片段,以rAAV9為載體,構(gòu)建相應(yīng)的rAAV9-Ps1-shRNA,體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,采用Western Blot技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)PS

2、1蛋白的表達(dá)水平,篩選可相對高效抑制Ps1基因表達(dá)的rAAV9-Ps1-shRNA,采用尾靜脈注射rAAV9-Ps1及rAAV9-Ps1-shRNA的方式分別體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠心肌組織并檢測其體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果:轉(zhuǎn)染一周后,rAAV9-Ps1可使大鼠心肌組織中PS1蛋白的表達(dá)水平提高26%,rAAV9-Ps1-shRNA使大鼠心肌組織中PS1蛋白表達(dá)水平降低63%,日在1-4周內(nèi)轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定。結(jié)論:本實驗中構(gòu)建的rAAV9-Ps1及rAAV9

3、-Ps1-shRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果良好,可進(jìn)一步用于后續(xù)的動物體內(nèi)實驗。
  第二部分 Ps1基因?qū)φ4笫笮募〖?xì)胞SR鈣容量的影響
  目的:通過轉(zhuǎn)染的方式改變大鼠心肌組織中Ps1基因的表達(dá)水平,研究Ps1基因?qū)φ4笫笮募〖?xì)胞SR鈣容量的影響。
  方法:
  (1)實驗分組及動物模型的建立
  CTRL組(n=5):經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水
  Ps1-UP組(n=8):經(jīng)尾靜脈注射rAAV9-Ps1

4、
  Ps1-KD組(n=8):經(jīng)尾靜脈注射rAAV9-Ps1-shRNA。
  (2)心功能檢測
  采用M型超聲檢測系統(tǒng)對各組大鼠心功能進(jìn)行檢測。
  (3)心肌組織顯微及超微結(jié)構(gòu)的觀察
  取大鼠心肌組織,用4%多聚甲醛固定,經(jīng)石蠟包埋、Massion染色后觀察各組大鼠心肌顯微學(xué)結(jié)構(gòu)的改變;另取大鼠心肌組織左心室部分,經(jīng)電鏡常規(guī)制樣后,利用透射電子顯微鏡觀察并記錄各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的改變。

5、>  (4)心肌細(xì)胞SR鈣容量的檢測
  采用酶解法急性分離各組大鼠心肌細(xì)胞,經(jīng)Fluo5N-AM負(fù)載后,采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測各組大鼠心肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度;另取部分心肌細(xì)胞經(jīng)Fluo-4AM負(fù)載后,用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測咖啡因誘導(dǎo)的鈣瞬變。
  結(jié)果:
  (1)各組大鼠心功能指標(biāo)分析
  與CTRL組(n=5)相比,Ps1-KD組大鼠(n=8)的射血分?jǐn)?shù)(EF%)及縮短分?jǐn)?shù)(FS%)均明顯降低(EF%:

6、 F=57.215,60.48±1.67 VS72.28±2.86,P=0.000; FS%:F=97.418,31.70±1.69 VS42.84±2.30,P=0.000),左室舒張末容積(LVEDV)與左室收縮末容積(LVESV)均明顯增大(LVEDV: F=47.647,336.39±9.07 VS273.40±6.29,P=0.000; LVESV: F=251.901,118.03±4.55 VS74.50±5.75,P=0

7、.000);心重體重比(HW/BW)增加(F=6.116,3.87±0.16VS3.70±0.13,P=0.033); Ps1-UP組大鼠心功能較CTRL組無明顯變化(EF%: F=57.215,71.69±2.67 VS72.28±2.86,P=0.668; FS%:F=97.418,41.21±0.98 VS42.84±2.30,P=0.096; LVEDV: F=47.647,267.55±22.15 VS273.40±6.29,

8、P=0.509; LVESV: F=251.901,72.99±3.23 VS74.50±5.75,P=0.556;HW/BW: F=6.116,3.65±0.089 VS3.70±0.13,P=0.520)。
  (2)各組大鼠心肌組織顯微及超微結(jié)構(gòu)分析
  Ps1-KD組大鼠心肌組織中偶見電子密度較高的線粒體,閏盤部分增寬,膠原纖維含量略增加;Ps1-UP組大鼠心肌組織顯微及超微結(jié)構(gòu)較CTRL組無明顯變化。
  (

9、3)各組大鼠心肌細(xì)胞SR鈣容量的改變
  Ps1-KD組大鼠心肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度及咖啡因誘導(dǎo)的鈣瞬變均較CTRL組顯著降低(Fluo5N-AM:ΔF/F0: F=227.131,42.29±2.31 VS60.61±1.93,P=0.000,n=12; Fluo4-AM: F=106.374,112.23±6.96 VS136.34±3.11,P=0.000,n=12),Ps1-UP大鼠心肌細(xì)胞SR鈣容量較CTRL組無顯著變化(Flu

10、o5N-AM:ΔF/F0: F=227.131,60.75±2.97 VS60.61±1.93,P=0.888,n=12; Fluo4-AM:ΔF/F0: F=106.374,136.30±2.71 VS136.34±3.11,P=0.985,n=12)。
  結(jié)論:生理狀態(tài)下,Ps1基因過表達(dá)對大鼠心功能、心肌結(jié)構(gòu)以及心肌細(xì)胞SR鈣容量并無顯著影響;Ps1基因沉默使大鼠心功能降低,心肌組織中部分超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,心肌細(xì)胞SR鈣容

11、量降低。
  第三部分 Ps1基因?qū)π牧λソ叽笫笮募〖?xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響
  目的:建立大鼠心力衰竭模型,研究Ps1基因?qū)π牧λソ叽笫笮墓δ艿挠绊懖⑦M(jìn)一步探討其鈣循環(huán)機(jī)制。
  方法:
  (1)實驗分組與動物模型的建立
  CTRL組(n=5):開胸后縫合
  HF組(n=10):心梗手術(shù)(結(jié)扎大鼠心臟冠脈左前降肢)
  Ps1-UP-HF組(n=10):尾靜脈注射rAAV9-Ps1,3天后進(jìn)行心

12、梗手術(shù)
  Ps1-KD-HF組(n=10):尾靜脈注射rAAV9-Ps1-shRNA,3天后進(jìn)行心梗手術(shù)。
  (2)檢測指標(biāo)
  心梗手術(shù)后第4周,檢測各組大鼠心功能、心肌組織超微及顯微結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞SR鈣容量及自發(fā)鈣釋放的變化(具體檢測方法同第二部分);另采用Western Blot技術(shù)檢測各組大鼠心肌組織中RyR2及SERCA2a的表達(dá)水平。
  結(jié)果:
  (1)各組大鼠心功能指標(biāo)分析
  

13、與CTRL組(n=5)相比,HF組大鼠(n=9)的EF%及FS%均明顯降低(EF%:F=241.562,43.24±1.72 VS72.28±2.86,P=0.000; FS%: F=226.552,22.32±1.22 VS42.84±2.30,P=0.000);LVEDV與LVESV顯著增加(LVEDV: F=793.539,459.81±16.24 VS273.40±26.76,P=0.000; LVESV: F=601.979,

14、261.78±19.58 VS72.30±13.36,P=0.000)。Ps1-KD-HF大鼠(n=8)的EF%及FS%較HF組進(jìn)一步降低(EF%: F=241.562,25.84±2.76 VS43.24±1.72,P=0.000; FS%: F=226.552,17.40±2.10 VS22.32±1.22,P=0.000),LVEDV與LVESV較HF組進(jìn)一步增加(LVEDV: F=793.539,709.94±11.29VS45

15、9.81±16.24,P=0.000; LVESV: F=601.979,544.88±36.59 VS261.78±19.58,P=0.000)。Ps1-UP-HF組大鼠(n=9)的EF%及FS%較HF組升高(EF%: F=241.562,51.74±4.28 VS43.24±1.72,P=0.000; FS%: F=226.552,28.23±1.68VS22.32±1.22,P=0.000); LVEDV與LVESV較HF組減小(

16、LVEDV: F=793.539,356.26±18.93 VS459.81±16.24,P=0.000; LVESV: F=601.979,163.08±6.53 VS261.78±19.58,P=0.000)。
  (2)各組大鼠心肌組織顯微及超微結(jié)構(gòu)分析
  HF組大鼠心室腔增大,前間隔運動減弱,心肌纖維化嚴(yán)重,肌絲排列疏松紊亂,線粒體及閏盤損傷嚴(yán)重。Ps1-KD-HF大鼠出現(xiàn)雙心室擴(kuò)張,前間隔運動消失甚至出現(xiàn)反向運動

17、,心肌嚴(yán)重纖維化,部分肌絲斷裂,溶解,線粒體損傷嚴(yán)重,閏盤結(jié)構(gòu)模糊不清,甚至斷裂。Ps1-UP-HF大鼠心肌組織中,心肌重構(gòu)現(xiàn)象得到顯著緩解。
  (3)各組大鼠心肌細(xì)胞SR鈣容量及自發(fā)鈣釋放的改變
  HF組大鼠心肌細(xì)胞SR鈣容量較CTRL組顯著降低(Fluo5N-AM: F=855.261,29.45±1.71 VS61.35±2.80,P=0.000,n=12; Fluo4-AM: F=1216.898,60.20±2

18、.37 VS102.64±4.51,P=0.000,n=12),同時自發(fā)鈣釋放增加(F=1161.880,21.50±2.20 VS3.50±1.00,P=0.000,n=12); Ps1基因沉默導(dǎo)致心衰大鼠心肌細(xì)胞SR鈣容量進(jìn)一步降低(Fluo5N-AM: F=855.261,20.71±2.39 VS29.45±1.71,P=0.000,n=12; Fluo4-AM:F=1216.898,29.10±2.37 VS60.20±2.3

19、7,P=0.000,n=12),自發(fā)鈣釋放進(jìn)一步增加(F=1161.880,40.83±2.12 VS21.50±2.20,P=0.000,n=12)。Ps1基因過表達(dá)可增加心衰大鼠心肌細(xì)胞SR鈣容量(Fluo5N-AM: F=855.261,39.23±0.82 VS29.45±1.71,P=0.000,n=12; Fluo4-AM: F=1216.898,78.69±2.37 VS60.20±2.53,P=0.000,n=12),同

20、時自發(fā)鈣釋放顯著減少(F=1161.880,9.25±0.97 VS21.50±2.20,P=0.000,n=12)。
  (4)蛋白分子生物學(xué)檢測結(jié)果分析
  HF組大鼠心肌組織中SERCA2a的表達(dá)水平顯著降低(F=370.933,0.525±0.0250VS0.908±0.0148,P=0.0662,n=3),Ps1基因沉默引起大鼠心肌組織中RyR2表達(dá)水平降低(F=56.102,0.771±0.0195 VS0.90

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