共載多西他賽和siATG7的硫辛酸多肽膠束構(gòu)建及其抗乳腺癌作用研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重威脅全球女性健康的常見惡性腫瘤之一。在美國(guó)女性癌癥中是除了皮膚癌之外的最普遍的癌癥，占接近三分之一。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2018年最新數(shù)據(jù)表明，乳腺癌在預(yù)計(jì)新發(fā)人數(shù)上位居第一，預(yù)計(jì)死亡人數(shù)上排名第二（僅次于肺及支氣管癌）。目前，乳腺癌治療存在很多難點(diǎn)，特別是一些患者在接受治療時(shí)發(fā)生耐藥及術(shù)后放化療后腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。近些年來，有研究表明，自噬在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及治療過程中發(fā)揮著重要的作用。如何改善乳腺癌的治療效果已成為研究熱點(diǎn)。自噬

2、是一種廣泛存在于真核生物的細(xì)胞中高度保守的一種依賴溶酶體的降解途徑，是通過清除自身衰老、受損的細(xì)胞器，或通過降解蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子供細(xì)胞再次利用，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬常作為一種細(xì)胞在特殊情況下的保護(hù)自我的一種機(jī)制，例如在機(jī)體出現(xiàn)損傷、缺氧、應(yīng)激等病理生理情況后一種調(diào)控細(xì)胞代謝活動(dòng)的過程，可被認(rèn)為是與化療失敗的重要耐藥機(jī)制之一。本課題選用廣譜抗癌藥多西他賽(DTX)和自噬抑制ATG7siRNA(siATG7)，通過硫辛酸修飾的

3、固有無序多肽形成的多肽膠束加以介導(dǎo)，并載入化療藥多西他賽，從體內(nèi)和體外對(duì)其抗乳腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　本課題分為三個(gè)部分，第一部分對(duì)共載多西他賽和siATG7的硫辛酸多肽膠束的構(gòu)建及表征進(jìn)行了報(bào)道。通過固相合成法合成了含有硫辛酸、賴氨酸、纈氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸的硫辛酸修飾的固有無序多肽的單體，然后進(jìn)一步通過制備型高效液相色譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，且純度檢測(cè)結(jié)果顯示符合實(shí)驗(yàn)要求。利用硫辛酸五元環(huán)內(nèi)二硫鍵在一定比例的半

4、胱氨酸催化下可實(shí)現(xiàn)分子間交聯(lián)，進(jìn)一步形成多個(gè)多肽單體聚合的載體。通過核磁共振氫譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示了多肽單體聚合成功。然后采用超聲乳化的方法制備膠束及載藥，利用多肽膠束結(jié)構(gòu)中分別含有疏水性的空腔以及富含帶正電的陽(yáng)離子型氨基酸，分別包載疏水性化療藥物多西他賽和包裹壓縮帶負(fù)電荷的siATG7基因藥物。表征結(jié)果表明超聲乳化法所制備的多肽膠束的平均粒徑為165nm左右，電位值在31mV左右，且載藥量在8.81％左右。
　　本課題

5、的第二部分進(jìn)一步報(bào)道了共載化療藥多西他賽和siATG7的硫辛酸多肽膠束抗乳腺癌的體外評(píng)價(jià)。首先我們選用了以下五種不同種類乳腺癌細(xì)胞（MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-468，BT474，SKBR-3），對(duì)其進(jìn)行抗增殖、促凋亡，以及周期阻滯實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明不同種類乳腺癌細(xì)胞對(duì)于自噬水平的依賴性不同，抑制自噬所引起的療效也不相同。我們選擇其中MCF-7細(xì)胞進(jìn)一步研究通過siATG7對(duì)自噬的調(diào)控研究其抗乳腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行研究

6、。用尼羅紅代替多西他賽，熒光素FAM標(biāo)記siATG7，對(duì)其攝取進(jìn)行考察，結(jié)果顯示尼羅紅和siATG7可以在多肽膠束的介導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，硫辛酸多肽膠束可以有效介導(dǎo)siATG7在MCF-7細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用并抑制了化療藥多西他賽引起的自噬，通過自噬抑制而實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)化療藥的療效的作用。多西他賽和siATG7可協(xié)同抗乳腺癌細(xì)胞增殖及周期阻滯并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。自噬抑制作用的考察上，我們通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)mRFP-EGFP-LC3的MC

7、F-7細(xì)胞，然后對(duì)不同給藥組的自噬流進(jìn)行了考察，同時(shí)，通過Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)對(duì)自噬相關(guān)的蛋白及ATG7mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了考察，并通過電鏡考察不同給藥組產(chǎn)生的自噬泡的情況。結(jié)果顯示共載多西他賽和siATG7的硫辛酸多肽膠束可以有效的抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的自噬水平。
　　本課題的第三部分對(duì)共載多西他賽和siATG7的硫辛酸多肽膠束抗乳

8、腺癌體內(nèi)作用機(jī)制進(jìn)行了報(bào)道。實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了MCF-7乳癌裸鼠移植瘤模型，通過siRNA用Cy5熒光標(biāo)記后通過多肽膠束進(jìn)行體內(nèi)遞送研究，活體成像結(jié)果顯示膠束具有較好的體內(nèi)靶向性。腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)和腫瘤組織的HE染色切片觀察顯示，多西他賽和siATG7在硫辛酸多肽膠束介導(dǎo)下，可以起到協(xié)同抑制裸鼠乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)。最后進(jìn)一步通過HE對(duì)其安全性進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該多肽膠束具有較低的系統(tǒng)性毒性。免疫組化實(shí)驗(yàn)也表明，多西他賽和siATG7硫辛酸多