鱖ASC和Cathepsin B的功能研究.pdf

1、鱖是我國(guó)重要的魚類養(yǎng)殖品種，而近年來傳染性脾腎壞死病毒(InfectiousSpleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV)對(duì)鱖養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了研究病毒與宿主的相互作用，在ISKNV感染鱖的抑制性消減雜交cDNA文庫基礎(chǔ)上，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)點(diǎn)狀聚集含CARD蛋白(Apoptosis-associated Speck-like protein containing a CA

2、RD，ASC)和組織蛋白酶B(Cathepsin B，CathB)兩個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(Expression Sequence Tag，EST)。 ASC是一個(gè)擁有氨基端PYRIN結(jié)構(gòu)域和羧基端CARD結(jié)構(gòu)域的雙結(jié)構(gòu)蛋白，它作為一種調(diào)控蛋白，可以通過它所擁有的兩個(gè)蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域去募集與其同源的含有PYRIN和CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白，從而參與天然免疫、細(xì)胞凋亡等多種信號(hào)通路。鱖ASC(mfasc)cDNA全長(zhǎng)899bp，編碼201a

3、a的蛋白，功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ASC編碼蛋白含有氨基端90個(gè)氨基酸殘基編碼的PYRIN和羧基端90個(gè)氨基酸殘基編碼的CARD。mfasc基因全長(zhǎng)3954bp，包括有有四個(gè)外顯子，三個(gè)內(nèi)含子。Nonhem blot分析，mfasc在頭腎組織中的表達(dá)最高，其次是鰓，后腎，脾和腸，在皮膚和肝中的表達(dá)較少。在ISKNV感染鱖過程中，我們分析了mfasc mRNA隨病毒感染的表達(dá)時(shí)相，發(fā)現(xiàn)在所檢測(cè)組織中的mRNA的表達(dá)沒有發(fā)生很明顯的變化。我們選取了

4、不表達(dá)ASC的人293T細(xì)胞來進(jìn)行mfASC體外功能的研究，發(fā)現(xiàn)mfASC全蛋白的表達(dá)時(shí)，在細(xì)胞核周形成點(diǎn)狀聚集，當(dāng)我們單獨(dú)表達(dá)單個(gè)功能結(jié)構(gòu)域時(shí)，這種聚集現(xiàn)象隨即消失。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的2937r細(xì)胞中，不論是否用TNFa和LPS刺激，mfASC都能夠抑制NF-kB的活性。 CathB是木瓜樣半胱氨酸組織蛋白酶的一種，通常定位于溶酶體中，主要行使蛋白降解以維持細(xì)胞正常代謝調(diào)控的作用，但在多種病理狀況下，CathB出現(xiàn)過表達(dá)，重新定位和

5、分泌到溶酶體外的現(xiàn)象。鱖CathB(mfcathB)的cDNA序列長(zhǎng)度為2129 bp，編碼330個(gè)氨基酸的蛋白。Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，mfcathB有兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，在脾臟組織中的表達(dá)最高，其次是后腎、頭腎、肝臟和腸，在鰓和皮膚中的表達(dá)較少，并且在鰓中只能檢測(cè)到一個(gè)轉(zhuǎn)錄本。在ISKNV感染鱖過程中，我們分析了mfcathB mRNA隨病毒感染的表達(dá)時(shí)相，發(fā)現(xiàn)在所檢測(cè)組織中的mRNA的表達(dá)都有不同程度的升高現(xiàn)象。為了進(jìn)一