人類基因SEC15L3和SEC14L3的克隆與功能研究.pdf

1、本論文分兩部分，分別研究了人類exocyst復(fù)合體一個(gè)重要亞基基因SECl5L3和與膽固醇合成相關(guān)基因SEC14L3的初步生物學(xué)功能。 在真核生物細(xì)胞中保守的exocyt復(fù)合體是介導(dǎo)胞吐作用(exocytosis)的關(guān)鍵元件，而Sec15蛋白(Sec15p)是exocyst與其他蛋白及膜結(jié)構(gòu)結(jié)合的中介。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Sec15p與眾多的不同蛋白結(jié)合，使得exocyst可能在內(nèi)吞作用，細(xì)胞周期及細(xì)胞骨架形成等過程中也起作用。我

2、們從人胎腦cDNA文庫中克隆到一條新的See15基因(SEC15L1，NM-019053)的剪接體cDNA——SEC15L3，并已提交GenBank，登錄號為EF571007。逆轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量實(shí)驗(yàn)顯示，該基因在胰腺，脾臟，胸腺，前列腺，和睪丸幾個(gè)組織表達(dá)量較高，而且與其剪接體SECl5L，的組織表達(dá)譜有明顯差異。生物信息學(xué)方法模擬SEC15L3蛋白，并與SEC15L1比較，顯示兩者有不同的高級結(jié)構(gòu)，我們推測兩者可能是不同exocy

3、st的成分，并且在不同組織中行使不同功能。 SEC14L3的cDNA全長2082bp，編碼一個(gè)長度為400個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。蛋白序列分析顯示SEC14L3具有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：CRAL-TRIO和GOLD結(jié)構(gòu)域。信息學(xué)分析顯示SEC14L3與TAP/SPF(α-生育酚關(guān)聯(lián)蛋白/上清蛋白因子)同源，可能為TAP/SPF蛋白家族的新成員。TAP/SPF在體內(nèi)參與調(diào)節(jié)膽固醇合成與α生育酚代謝這兩條重要的生理途徑，提示SEC14L3

4、可能具有類似的功能。綠熒光融合蛋白表達(dá)顯示SEC14L3定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)而GOLD結(jié)構(gòu)域可能介導(dǎo)其準(zhǔn)確定位。真核表達(dá)SEC14L3及其系列突變體蛋白顯示SEC14L3能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞株7721的膽固醇合成，而且CRAL-TRIO和GOLD結(jié)構(gòu)域及某些重要氨基酸殘基對這種促進(jìn)作用是必需的。α生育酚刺激實(shí)驗(yàn)顯示SEC14L3的亞細(xì)胞定位及對膽固醇合成的促進(jìn)作用均不受α生育酚刺激的影響。我們還提出了SEC14L3促進(jìn)膽固醇合成的可能途徑及后續(xù)可