白芍總苷在大鼠體內的排泄及其對CYP3A蛋白表達的影響.pdf

1、目的：白芍總苷(Total glucosides of paeony，TGP)是自白芍根中提取的有效部位，以芍藥苷(Paeoniflorin，Pae)和芍藥內酯苷(Albiflorin，Alb)的含量最高。課題組前期比較了TGP在正常和急性CCl4肝損傷大鼠體內的藥代動力學參數(shù)，發(fā)現(xiàn)其在正常和病理狀態(tài)下的參數(shù)明顯不同，并對TGP的胃腸吸收、血漿蛋白結合率、組織分布等特點進行了研究。為進一步研究TGP的藥代動力學，明確其體內排泄特點，研究

2、TGP對肝藥酶CYP3A蛋白表達的影響，本實驗以HPLC法為手段，采用固相萃取方法同時測定Pae和Alb在大鼠尿液、糞便和膽汁中的含量，明確TGP的主要排泄途徑，同時以正常大鼠和急性CCl4肝損傷大鼠為實驗對象，采用Western Blot法觀察TGP對大鼠CYP3A蛋白表達的影響，探討TGP保肝作用的相關機制。
　　方法：
　　1白芍總苷在大鼠體內的排泄研究
　　1.1色譜條件
　　采用phenomenex C

3、18色譜柱(4.6×250 mm，5μm)，流動相均為乙腈-0.1％冰乙酸，尿液樣品流動相比例為16:84，糞便及膽汁樣品比例均為13:87；流速1 mL/min；檢測波長232 nm；柱溫25℃；進樣量均為10μL。
　　1.2樣品預處理
　　1.2.1尿樣預處理
　　精密量取尿樣0.4mL，加入蒸餾水0.2 mL及內標龍膽苦苷溶液20μL，渦旋混勻后通過已活化的固相萃取小柱，先用10％的甲醇2 mL淋洗雜質，繼用甲

4、醇1 mL洗脫，洗脫液定容至1 mL，離心(12000 r/min)，取上清液10μL進樣分析。
　　1.2.2糞便預處理
　　將糞便樣品于-40℃保存24 h以上，冷凍干燥，稱定重量，研碎，取糞便凍干粉0.01 g，加入1 mL蒸餾水，渦旋混勻5 min，離心(12000 r/min)10 min，取上清液0.2 mL，加入蒸餾水0.2 mL及內標龍膽苦苷溶液20μL，渦旋混勻，其余處理同“尿樣預處理”。
　　1.2

5、.3膽汁預處理
　　取膽汁樣品0.2 mL，其余操作同“尿樣預處理”。
　　1.3排泄研究
　　1.3.1 TGP在大鼠尿液和糞便中的排泄
　　Wistar大鼠5只，置代謝籠中，灌胃給予TGP水溶液(1.41 g/kg)，分別收集各時間段尿液及糞便，HPLC法測定樣品中Pae和Alb濃度，根據(jù)隨行標準曲線計算各自含量。
　　1.3.2 TGP在大鼠膽汁中的排泄
　　大鼠灌胃給予TGP水溶液(1.41

6、g/kg)，腹腔注射25％烏拉坦麻醉，分離膽總管并行膽管插管引流術，收集各時間段的膽汁，HPLC法測定樣品中Pae和Alb濃度，根據(jù)隨行標準曲線計算各自含量。
　　2白芍總苷對正常大鼠CYP3A蛋白表達的影響
　　25只大鼠按體重隨機分為5組(正常對照組，TGP低、中、高劑量組，陽性對照組)。正常對照組給予純化水，TGP低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予TGP0.47、1.41、2.82 g/kg，連續(xù)14天；陽性對照組于第1

7、1天腹腔注射地塞米松75 mg/kg，連續(xù)4天。第15天將各組大鼠斷頭處死，取肝，差速離心法制備肝微粒體，Western Blot法檢測CYP3A蛋白表達。
　　3白芍總苷對急性CCl4肝損傷大鼠CYP3A蛋白表達的影響
　　30只大鼠按體重隨機分為6組(正常對照組，模型組，TGP低、中、高劑量組，陽性對照組)。正常對照組與模型組給予純化水，TGP低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予TGP0.47、1.41、2.82 g/kg，

8、陽性對照組大鼠給予聯(lián)苯雙酯0.2 g/kg，連續(xù)14天。于末次給藥后2 h，除正常對照組注射等量生理鹽水，其余5組均皮下注射50％CCl4玉米油復制急性CCl4肝損傷模型，16h后將大鼠斷頭處死，取血分離血清測定ALT、AST；取肝，稱總重，計算肝臟系數(shù)；肝左葉的相同部位用10％甲醛溶液固定，常規(guī)石臘包埋，HE染色，光鏡下觀察組織損傷程度；部分肝組織差速離心法制備肝微粒體，Western Blot法檢測CYP3A蛋白表達。
　　結

9、果：
　　1白芍總苷在大鼠體內的排泄研究
　　1.1方法學考察
　　大鼠尿液、糞便和膽汁中Pae、Alb及內標峰在本條件下專屬性良好，陰性無干擾，日內和日間精密度RSD均在10％以內，準確度均在90％～110％之間，兩者及內標的提取回收率均在90％以上，樣品預處理前后室溫放置和凍融循環(huán)后仍保持穩(wěn)定。
　　1.2 TGP在大鼠尿液、糞便和膽汁中的排泄
　　大鼠灌胃給予1.41 g/kg TGP后，48 h尿液

10、和糞便及36 h膽汁中芍藥苷的累積排泄量分別為(610.0±53.9)、(60630.4±4546.3)、(5640.3±504.3)μg，占給藥量的(0.583±0.042)％、(59.11±6.87)％和(4.88±0.43)％；芍藥內酯苷的累積排泄量分別為(158.0±21.1)、(27315.1±2383.4)、(2462.1±211.2)μg，占給藥量的(0.424±0.056)％、(74.70±9.17)％和(5.98±0.

11、48)％。
　　2白芍總苷對正常大鼠CYP3A蛋白表達的影響
　　與正常對照組相比，陽性對照組給予地塞米松能夠顯著誘導CYP3A的蛋白表達(P＜0.01)，比正常對照組提高140％；TGP低、中劑量組較正常對照組有增高趨勢，分別較正常對照組提高9％、19％，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；TGP高劑量組顯著誘導CYP3A的蛋白表達，比正常對照組提高44％(P＜0.01)。
　　3白芍總苷對急性CCl4肝損傷大鼠CYP3

12、A蛋白表達的影響
　　3.1 TGP對急性CCl4肝損傷大鼠肝臟系數(shù)的影響
　　與正常對照組相比較，大鼠皮下注射CCl4后，模型組大鼠肝臟系數(shù)明顯上升，顯著高于正常對照組大鼠(P＜0.01)；與模型組比較，經TGP與DDB預處理能顯著降低肝損傷所致肝臟系數(shù)上升(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.2 TGP對CCl4所致大鼠急性肝損傷肝功能的影響
　　與正常對照組比較，模型組大鼠ALT、AST值明顯升高(P＜

13、0.01)；與模型組比較，預先給予TGP或DDB，能夠顯著降低ALT、AST水平(P＜0.05或P＜0.01)，且TGP高劑量組和陽性對照組療效明顯優(yōu)于TGP低、中劑量組。
　　3.3 TGP對CCl4所致大鼠急性肝損傷肝組織病理學觀察
　　正常對照組大鼠肉眼觀察肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤，邊緣整齊，質地柔軟；鏡下可見肝小葉結構正常，肝細胞排列整齊且胞核形態(tài)正常，肝細胞索清晰可辨，未見腫脹、壞死、炎性細胞浸潤等病理改變。模型組大

14、鼠肉眼見肝臟體積腫大，灰暗呈土黃色，邊緣變鈍，質脆；鏡下見肝小葉正常結構被破壞，肝組織結構紊亂，細胞境界不清并出現(xiàn)氣泡樣變，細胞索解離，肝細胞腫脹，出現(xiàn)彌散性炎癥細胞浸潤；TGP各給藥組和陽性對照組均不同程度地減輕上述病理改變。
　　3.4 TGP對急性CCl4肝損傷大鼠CYP3A蛋白表達水平的影響
　　與正常對照組相比，模型組CYP3A的蛋白表達明顯減少，較正常對照組下降31％(P＜0.01)；陽性對照組給予DDB顯著誘導

15、CYP3A的蛋白表達，比模型組提高59％(P＜0.01)；TGP低、中、高劑量組亦顯著誘導CYP3A的蛋白表達，分別較模型組提高16％(P＜0.05)、30％(P＜0.01)、52％(P＜0.01)。
　　結論：
　　1大鼠灌胃給予1.41g/kgTGP，尿液、糞便及膽汁中芍藥苷的累積排泄量分別占給藥量的(0.583±0.042)％、(59.11±6.87)％和(4.88±0.43)％；芍藥內酯苷的累積排泄量分別占給藥量的(

16、0.424±0.056)％、(74.70±9.17)％和(5.98±0.48)％。表明TGP在體內主要經膽汁排泄。
　　2正常大鼠灌胃給予低、中、高(0.47、1.41、2.82 g/kg)劑量TGP連續(xù)14天，24 h后制備肝微粒體，Western Blot法檢測CYP3A的蛋白表達。TGP低、中劑量組較正常對照組有增高趨勢，但無統(tǒng)計學意義；TGP高劑量組明顯誘導CYP3A的蛋白表達，較正常對照組提高44％，提示TGP的保肝機制