Tregs對實驗性矽肺發(fā)生發(fā)展中Th免疫應(yīng)答的調(diào)控及其機制研究.pdf

1、目的:矽肺是由于在生產(chǎn)過程中長期吸入游離性二氧化硅粉塵引起的一種以肺部纖維化為主的職業(yè)性疾病。在我國矽肺病例占塵肺總病例接近于50％，位居第一，是塵肺中危害最嚴重的一種疾病。雖然我國在控制游離性二氧化硅粉塵的產(chǎn)生和擴散、降低作業(yè)場所二氧化硅粉塵濃度、改善勞動環(huán)境方面做了大量工作，而且已取得了一定的成績，但其危害的形勢依然嚴峻，矽肺的預(yù)防和控制工作任重而道遠。因此，進行矽肺發(fā)病機制的研究對矽肺的預(yù)防及治療具有重要指導意義。
　　

2、矽肺的基本病理改變是矽結(jié)節(jié)形成和肺間質(zhì)彌漫性纖維化，其中矽結(jié)節(jié)是矽肺特征性的病理改變，按其纖維化程度可分為四級，即細胞性結(jié)節(jié)、纖維-細胞性結(jié)節(jié)、細胞-纖維性結(jié)節(jié)和纖維性結(jié)節(jié)，其纖維化程度隨時間進展逐級增加。矽肺的發(fā)病機制目前尚不清楚，目前對矽肺發(fā)病機制的研究認為：矽肺是一種肺部的慢性炎癥狀態(tài)，可分為肺泡炎期和纖維化反應(yīng)期。肺泡炎期肺內(nèi)大量巨噬細胞被激活，釋放大量的細胞因子，其中炎癥因子可增加毛細血管的通透性，使大量中性粒細胞募集到肺組織

3、內(nèi)，同時巨噬細胞作為抗原遞呈細胞(antigen presentingcells，APC)使大量初始T淋巴細胞活化為效應(yīng)T淋巴細胞，向肺內(nèi)炎癥部位遷移，分泌Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ等調(diào)控細胞免疫，其中IL-2通過自分泌和旁分泌效應(yīng)促進更多T淋巴細胞分化、成熟和增殖；IFN-γ促進巨噬細胞和中性粒細胞的吞噬作用，表現(xiàn)為細胞性結(jié)節(jié)。纖維化反應(yīng)期效應(yīng)T淋巴細胞分泌Th2型細胞因子IL-4、IL-10等，促進巨噬細胞釋放多肽生長因子

4、，調(diào)控纖維母細胞的分化以及成纖維細胞的趨化作用、增殖及膠原的合成，同時抑制Th1型反應(yīng)，細胞性結(jié)節(jié)逐漸向纖維性結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)化。矽肺的發(fā)生過程是Th1型細胞免疫應(yīng)答到Th2型細胞免疫應(yīng)答的一個有序的過程，是一個多細胞參與多因子調(diào)控的復(fù)雜的免疫過程。雖然Th1型細胞免疫應(yīng)答的有效建立對肺內(nèi)游離二氧化硅粉塵的清除具有重要意義，但過度進行卻使肺組織的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞。
　　 近年來，一類以表達IL-17為特征的新CD4+T細胞亞群Th17細胞

5、引起了廣泛的關(guān)注。大量研究證實，Th17細胞在人類自身免疫性疾病如實驗性變應(yīng)性腦脊髓膜炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植排斥，及嚴重的呼吸道過敏性炎癥性疾病等的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，特別是在炎癥發(fā)展早期發(fā)揮的促炎性作用，提示炎癥性疾病中T細胞免疫應(yīng)答的建立并不僅僅是一個由Th1型到Th2型的有序過程，在T細胞免疫應(yīng)答建立的早期可能存在著Th17型細胞免疫應(yīng)答。在實驗性矽肺的發(fā)生發(fā)展中，由Th17型免疫應(yīng)答向Th1型免疫應(yīng)

6、答向Th2型細胞免疫應(yīng)答的適時轉(zhuǎn)化對于矽肺的發(fā)展及預(yù)后具有重要的影響，這一過程的啟動或平衡出現(xiàn)紊亂都將導致疾病慢性化或正常肺組織的嚴重損傷，因此需要一種免疫調(diào)控機制對這一過程進行有效的調(diào)控。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(CD4+CD25+regulatory T cells，簡稱Tregs)是一類具有免疫調(diào)控功能的T淋巴細胞亞群，約占人和小鼠外周血CD4+T淋巴細胞的5％-10％。Tregs能夠特異地表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(叉狀頭

7、/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子)和表面分子CD25(IL-2Rα)、CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白-4)和GITR(糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體)。其中，F(xiàn)oxp3對Tregs的發(fā)育具有關(guān)鍵作用，是其特征性標志。Tregs通過細胞-細胞直接接觸和間接抑制兩種方式發(fā)揮免疫學調(diào)控作用。其中，細胞-細胞直接接觸是通過其表面膜分子CD25、CTIA-4、GITR等的粘附作用及分泌穿孔素或顆粒酶依賴機制直接抑制或殺傷效應(yīng)細胞；間接抑制主要表現(xiàn)為

8、分泌細胞因子IL-10、TGF-β對其它細胞進行免疫調(diào)控。其中IL-10主要通過抑制樹突狀細胞的MHCⅡ和共刺激因子的表達等機制抑制初始T細胞的活化，使獲得性免疫反應(yīng)受到抑制；通過抑制Th2型細胞因子的產(chǎn)生、IgE的合成、肥大細胞和嗜酸性粒細胞的生存與活化等機制來抑制Th2型反應(yīng)。另外，無論是在炎癥還是纖維化反應(yīng)階段過量表達IL-10都可以通過誘導IL-4和IL-13的表達發(fā)揮前纖維化活性。TGF-β是一個能調(diào)控細胞生長、分化、細胞外基

9、質(zhì)形成以及具有免疫抑制作用的蛋白家族。TGF-β可以抑制T細胞的活化，效應(yīng)細胞的殺傷活性；在Th1型免疫反應(yīng)中，TGF-β抑制INF-γ，TNF-α，IL-2的產(chǎn)生，對抗INF-γ，TNF-α的活性。
　　 Tregs在矽肺的發(fā)生發(fā)展過程中怎樣調(diào)控Th1/Th2應(yīng)答和Th1/Th2極化的?影響Th1與Th2應(yīng)答的時效特征如何?機制如何?是否是通過抑制初始T細胞的活化或效應(yīng)T淋巴細胞的活性調(diào)控免疫應(yīng)答?是否通過調(diào)控Th1/Th2極

10、化而影響矽肺的病理進程?Tregs對矽結(jié)節(jié)形成的影響如何?作用機制如何?
　　 為回答上述問題，我們擬利用鼠矽肺模型，特別是采用Tregs體內(nèi)阻斷實驗，直接觀察Tregs在矽肺發(fā)生發(fā)展過程中的作用地位，通過對比分析不同模型免疫應(yīng)答的變化特點，以期確立Tregs在矽肺Th應(yīng)答建立和Th1/Th2極化調(diào)控過程中相關(guān)的效應(yīng)機制，旨在為矽肺的預(yù)防和有效控制提供新的理論依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 1、建立不同Tregs

11、的C57BL/6小鼠矽肺模型C57BL/6小鼠(6-8w齡，雌性)經(jīng)腹腔注射100μg anti-CD25 mAb，消除小鼠體內(nèi)Tregs，建立抗體消除模型。單純矽肺模型組、對照組C57BL/6小鼠腹腔注射等體積的IgG1抗體?？贵w消除組、單純矽肺模型組、對照組C57BL/6小鼠分別行暴露式氣管內(nèi)注入法灌注二氧化硅顆粒懸液和生理鹽水。將不同Tregs的C57BL/6小鼠矽肺模型各組動物分別于7，28，56天處死，收集BALF；收集肺門淋

12、巴結(jié)、脾組織，用于制備細胞懸液。摘取肺臟，部分-80℃保存；部分固定，用于病理實驗。
　　 2、Tregs對矽肺炎性特征影響的觀察將不同時間各組動物收集的BALF500r/min，4℃，離心10min，收集細胞懸液，取20ul細胞懸液至于細胞計數(shù)板上，進行細胞計數(shù)。細胞數(shù)=(四個大格的細胞總數(shù)/4)×104。取400ul肺泡灌洗液，室溫1500rpm離心8min，棄上清，加入200ul FCS混勻，推片，室溫晾干，用甲醇固定，3

13、7℃溫箱過夜，用Giemsa染液染色，室溫15min；蒸餾水背沖，晾干。油鏡下計數(shù)200個細胞中巨噬細胞，中性粒細胞，淋巴細胞的數(shù)量。
　　 3、Tregs對矽結(jié)節(jié)病理過程影響的動態(tài)觀察肺組織常規(guī)石蠟切片(5μm)，進行HE染色，石蠟切片放入烘箱內(nèi)烘烤2小時；然后將肺組織切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；梯度酒精浸泡各1分鐘，脫去二甲苯；流水沖洗5分鐘；蘇木精染色液浸染10分鐘，自來水沖洗，返藍；2％鹽酸

14、酒精20秒至1分鐘；自來水沖洗12到24小時；0.5％伊紅染液浸染1至2分鐘，流水沖洗；梯度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片。小鼠實驗性矽肺采用四級分類法：未發(fā)生病變用“0”表示，Ⅰ級為細胞性結(jié)節(jié)；Ⅱ級為纖維細胞性結(jié)節(jié)；Ⅲ級為細胞纖維性結(jié)節(jié)；Ⅳ級為纖維性結(jié)節(jié)。
　　 4、不同小鼠模型中Tregs數(shù)量的觀察取0.1ml脾、肺門淋巴結(jié)、肺泡灌洗液細胞懸液(106細胞)，應(yīng)用anti-CD3-Percp，anti-CD4-PE-CY

15、7，anti-CD25-APC，4℃條件下避光孵育30min，3％FBS的PBS清洗細胞兩次，破膜液孵育細胞30min，再次清洗細胞兩次，應(yīng)用anti-FOXP3-FITC，anti-CTLA4-PE孵育細胞1hour，進行胞內(nèi)染色。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300ul，混勻，流式細胞儀檢測。FACSCantoⅡ流式細胞儀Diva軟件進行分析。以FSC、SSC、anti-CD3-percp、anti-CD4-PE-cy7定義CD4

16、+T細胞，計算這一細胞群內(nèi)CD3+CD4+CD25+Foxp3+細胞的比例所占的比例。
　　 5、Tregs對Th應(yīng)答建立時效特征和效應(yīng)差異的影響取100mg肺組織，加入1ml Trizol試劑，冰浴勻漿，12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新管中，室溫靜置5分鐘；每管加入200μl氯仿，用力震蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘；4℃，12000rpm，離心15分鐘；從每管中吸取上清至另一新的1.5ml EP管。加入等體積-20

17、℃預(yù)冷的0.5ml異丙醇，混勻后室溫沉淀10分鐘；4℃，12000rpm離心10分鐘后，棄上清；加入4℃預(yù)冷的75％乙醇，洗滌沉淀及離心管壁；4℃，7500rpm離心5分鐘，棄上清；室溫干燥5-10分鐘；加入30μlRNase-free水，至完全溶解，測定RNA濃度并調(diào)整至11μg/μl。參照Invitrogen公司的逆轉(zhuǎn)錄酶操作說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，即在PCR反應(yīng)管中加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，每管加入2μgRNA樣品和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液

18、。按下列條件進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15分鐘，85℃5秒鐘。設(shè)定程序為兩步法real time定量，預(yù)變性90℃30秒，之后每一步變性95℃5秒，退火延伸60℃34秒，共進行40個循環(huán)；相對定量法計算各組小鼠目標基因IL-2、IL-4及IL-17mRNA相對表達量。
　　 6、Tregs對實驗性矽肺Th免疫應(yīng)答調(diào)控機制的研究取0.1ml脾、肺門淋巴結(jié)(106細胞)，應(yīng)用anti-CD3-Percp，anti-CD4-PE-CY7，

19、anti-CD25-APC，4℃條件下避光孵育30min，3％FBS的PBS清洗細胞兩次，破膜液孵育細胞30min，再次清洗細胞兩次，應(yīng)用anti-FOXP3-FITC，anti-CTLA4-PE孵育細胞1hour，進行胞內(nèi)染色。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300ul，混勻，流式細胞儀檢測。FACSCantoⅡ流式細胞儀Diva軟件進行分析。以FSC、SSC、anti-CD3-percp、anti-CD4-PE-cy7定義CD4+T

20、細胞，計算這一細胞群內(nèi)CD3+CD4+CD25+Foxp3+CTLA4+細胞數(shù)量。取100mg肺組織，加入1ml Trizol試劑，冰浴勻漿，12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新管中，室溫靜置5分鐘；每管加入200μl氯仿，用力震蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘；4℃，12000rpm，離心15分鐘；從每管中吸取上清至另一新的1.5ml EP管。加入等體積-20℃預(yù)冷的0.5ml異丙醇，混勻后室溫沉淀10分鐘；4℃，12000rpm

21、離心10分鐘后，棄上清；加入4℃預(yù)冷的75％7，醇，洗滌沉淀及離心管壁；4℃，7500rpm離心5分鐘，棄上清；室溫干燥5-10分鐘；加入30μl RNase-free水，至完全溶解，測定RNA濃度并調(diào)整至1μ/μl。參照Invitrogen公司的逆轉(zhuǎn)錄酶操作說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，即在PCR反應(yīng)管中加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，每管加入2μgRNA樣品和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。按下列條件進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15分鐘，85℃5秒鐘。設(shè)定程序為兩步

22、法real time定量，預(yù)變性90℃30秒，之后每一步變性95℃5秒，退火延伸60℃34秒，共進行40個循環(huán)；相對定量法計算各組小鼠目標基因IL-10、TGF-βmRNA相對表達量。
　　 7、統(tǒng)計學分析全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，統(tǒng)計結(jié)果表示為mean士S.E.M，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計學差異；當差異有統(tǒng)計學意義時，用SNK法進行組間比較，p<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果:

23、
　　 1、腹腔注射CD25抗體有效的消除了小鼠體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞抗體消除組小鼠腹腔注射抗CD25單克隆抗體，對照組及模型組小鼠腹腔注射抗IgG1抗體，經(jīng)流式細胞技術(shù)檢測，染塵后7天、28天、56天抗體消除組小鼠脾組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞占CD4+細胞比例較模型組、對照組顯著降低，差別具有統(tǒng)計學意義。腹腔注射CD25抗體有效的消除了小鼠體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞。
　　 2、不同組別小

24、鼠肺泡灌洗液炎性細胞分類計數(shù)結(jié)果染塵后7天，抗體消除組小鼠肺泡灌洗液細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)較模型組升高，兩者均高于對照組，抗體消除組小鼠肺泡灌洗液淋巴細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)與模型組無明顯差異，兩者均高于對照組，差別有統(tǒng)計學意義。染塵后28天，模型組小鼠淋巴細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)量高于抗體消除組，兩者均高于對照組。模型組與抗體消除組中性粒細胞無明顯差異，兩者均高于對照組。染塵后56天，模型組淋巴細胞數(shù)高于抗體消除組，兩者均高于對照組?？贵w消除組細

25、胞總數(shù)、中性粒細胞、巨噬細胞數(shù)和模型組無明顯差異，兩者均高于對照組。
　　 3、Tregs對矽結(jié)節(jié)病理過程影響的動態(tài)觀察矽肺組7天肺組織病理觀察炎性細胞廣泛浸潤，肺泡間隔增厚，可見不規(guī)則的細胞性結(jié)節(jié)。28天矽肺組肺組織炎癥明顯減輕，細胞性結(jié)節(jié)較7天變大，數(shù)量增多，可見纖維細胞性結(jié)節(jié)。56天矽肺組肺組織炎癥基本消退，纖維細胞性結(jié)節(jié)增多，可見細胞纖維性結(jié)節(jié)?？贵w消除組小鼠7天炎性細胞浸潤明顯較矽肺組重，肺間隔明顯增厚，可見較多不規(guī)則

26、的細胞性結(jié)節(jié)。28天抗體消除組炎癥減輕，細胞性結(jié)節(jié)較7天略有增大，數(shù)量無明顯增多，結(jié)節(jié)中細胞略有減少。56天抗體消除組肺組織炎癥明顯減輕，可見不規(guī)則的細胞性結(jié)節(jié)和纖維細胞性結(jié)節(jié)。生理鹽水組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯病理改變。
　　 4、小鼠染塵后不同組織中Tregs數(shù)量的變化染塵后7天，模型組小鼠脾、肺門淋巴結(jié)、肺泡灌洗液中Tregs/CD4+比例高于對照組，兩者均高于抗體消除組。染塵后28天，模型組小鼠脾、肺門淋巴結(jié)Tr

27、egs/CD4+細胞的比例與對照組無明顯差異，兩者均高于抗體消除組，肺泡灌洗液中Tregs/CD4+比例高于對照組，兩者均高于抗體消除組。染塵后56天，模型組小鼠脾Tregs/CD4+細胞的比例略高于對照組，差別沒有統(tǒng)計學意義，兩者均高于抗體消除組；模型組與抗體消除組肺門淋巴結(jié)中Tregs/CD4+細胞的比例較對照組降低；模型組小鼠肺泡灌洗液中Tregs/CD4+比例高于對照組，兩者均高于抗體消除組。模型組小鼠脾、肺門淋巴結(jié)中Tregs

28、/CD4+細胞的比例隨時間成下降趨勢。
　　 5、Tregs對Th應(yīng)答建立時效特征和效應(yīng)差異的影響染塵后7天，模型組及抗體消除組小鼠肺組織中IL-2mRNA的含量較對照組升高。染塵后28天及染塵后56天，模型組小鼠肺組織中IL-2mRNA的含量與對照組無明顯差異，兩者均低于抗體消除組IL-2mRNA的含量差別有統(tǒng)計學意義。模型組小鼠IL-2mRNA的含量成降低趨勢；染塵后7天，模型組及抗體消除組小鼠肺組織中IL-4mRNA的含量

29、與對照組無明顯差異。染塵后28天，模型組小鼠肺組織中IL-4mRNA的含量較抗體消除組及對照組升高，但差別無統(tǒng)計學意義。染塵后56天，模型組小鼠肺組織中IL-4mRNA的含量，較抗體消除組高，兩者均高于對照組。模型組、抗體消除組小鼠IL-4mRNA的含量隨時間升高，模型組小鼠升高較抗體消除組更為顯著；染塵后7天，模型組較抗體消除組小鼠肺組織中IL-17mRNA的含量升高，兩者均高于對照組。染塵后28天，模型組小鼠肺組織中IL-17mRN

30、A的含量較抗體消除組及對照組升高。染塵后56天，模型組小鼠肺組織中IL-17mRNA的含量，較抗體消除組)高，兩者均高于對照組。模型組、抗體消除組小鼠IL-17mRNA的含量隨時間降低。
　　 6、Tregs對實驗性矽肺Th免疫應(yīng)答調(diào)控機制的研究染塵后7天，模型組小鼠脾、肺門淋巴結(jié)CTLA4細胞的數(shù)量較對照組升高，兩者均高于抗體消除組，差別具有統(tǒng)計學意義。染塵后28天，模型組小鼠脾CTLA4細胞的數(shù)量較對照組升高，兩者均高于抗體

31、消除組；模型組小鼠淋巴結(jié)CTLA4細胞數(shù)量與對照組無明顯差異，兩者均高于抗體消除組。染塵后56天，模型組小鼠脾組織中CTLA4細胞的數(shù)量與對照組無明顯差異，兩者均高于抗體消除組；模型組小鼠淋巴結(jié)CTLA4細胞數(shù)量與抗體消除組無明顯差異，均低于對照組。模型組小鼠脾、肺門淋巴結(jié)中CTLA數(shù)量隨時間降低?？贵w消除組和對照組脾、肺門淋巴結(jié)中CTLA數(shù)量隨時間無明顯變化；模型組小鼠肺組織中IL-10mRNA的含量較抗體消除組與對照組顯著升高。模型

32、組小鼠肺組織IL-10mRNA的表達量隨時間升高，染塵后56天與染塵后7天差別有統(tǒng)計學意義；染塵后7天，模型組小鼠肺組織中TGF-βmRNA的含量略高于抗體消除組與對照組，差別沒有統(tǒng)計學意義。染塵后28天，模型組與抗體消除組小鼠肺組織中TGF-βmRNA的含量較對照組高，差別有統(tǒng)計學意義。染塵后56天，模型組小鼠肺組織中TGF-βmRNA的含量，較抗體消除組及對照組升高。模型組小鼠TGF-βmRNA的含量隨時間升高，染塵后56天與染塵后