樹突狀細胞在實驗性矽肺發(fā)生發(fā)展中的作用與機制.pdf

1、目的：矽肺是由于長期吸入游離二氧化硅（SiO2）粉塵而引起的以肺組織炎癥和廣泛纖維化為特征的一種職業(yè)病，發(fā)病機制尚不清楚。國內(nèi)外以往研究發(fā)現(xiàn)，矽肺發(fā)生發(fā)展是多細胞參與、多因子調控的復雜過程，其中存在著細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫等多種免疫反應，但矽肺免疫的啟動與控制、抗原性質及抗原遞呈、獲得性免疫應答觸發(fā)與功能調控、免疫耐受與負相調控的方式與機制等關鍵環(huán)節(jié)尚不清楚或存在爭議。既往觀察矽肺免疫效應細胞主要見于巨噬細胞、淋巴細胞、肺上皮

2、細胞、中性粒細胞等，而近年來被證實處于免疫啟動、調控并維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)的樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是否參與矽肺的發(fā)生發(fā)展，尚未見系統(tǒng)化研究報道。DC與巨噬細胞有相近、交叉的結構與功能，其免疫反應樞紐性作用更為獨特，且于呼吸系統(tǒng)各部位均有存在，故推測DC在矽肺免疫反應中可能也具有一定的作用。構建實驗性矽肺大鼠模型，輔以體外實驗模型，采用免疫組化、細胞共培養(yǎng)、流式細胞術、電子顯微鏡觀察等技術，系統(tǒng)探索DC在二氧化

3、硅粉塵識別與攝取、矽肺炎癥與纖維化形成、調節(jié)矽肺免疫反應等方面的作用與機制，有助于深化對矽肺發(fā)生發(fā)展過程的認識，探討潛在的矽肺生物標志和關鍵靶點，并為矽肺預防、早期發(fā)現(xiàn)和有效干預研究提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法：⑴采用6~8周齡SPF級雄性SD大鼠，從外周血分離單個核細胞，體外利用重組大鼠白介素-4(rrIL-4)、重組大鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rrGM-CSF)和重組大鼠TNF-α(rrTNF-α)聯(lián)合誘導，獲得DC

4、。支氣管肺泡灌洗法提取SD大鼠肺泡巨噬細胞（alveolar macrophages，AM）。流式細胞術和酶聯(lián)免疫吸附測定法分別對誘導的DC進行 CD80、CD86、MHC II表型分子和IL-12p70、IL18細胞因子檢測。用流式細胞術和熒光倒置顯微鏡檢測DC對熒光微球的吞噬功能；光鏡和電鏡下初步觀察DC對SiO2粉塵的吞噬作用及吞噬前后細胞形態(tài)與結構的變化。CCK8法分別檢測不同濃度SiO2粉塵在不同作用時間下DC和AM細胞活性的

5、影響，確定后續(xù)染毒濃度。在建立DC和AM共培養(yǎng)模型（AM/DC）的基礎上，設置對照組（DC組）、共培養(yǎng)組（AM/DC組）、直接暴露組（DC+SiO2組）和間接暴露組（AM+SiO2/DC組），SiO2粉塵暴露48 h后，掃描電鏡下觀察DC的形態(tài)變化；流式細胞術檢測DC表型分子CD80、CD86、MHC II的表達和對熒光微球的吞噬情況；qRT-PCR和Western blot法檢測暴露后DC中IL-12、IL-18、TLR4、TLR9、

6、Myd88和NFκB等基因的mRNA和蛋白表達水平；尼龍毛柱法分離大鼠脾臟T細胞，暴露SiO2粉塵后的DC和T細胞1:10混合培養(yǎng)24 h，熒光倒置顯微鏡下觀察DC和T細胞共培養(yǎng)后的細胞形態(tài)，流式細胞術檢測Th1、Th2細胞分型。⑵SD大鼠60只，隨機分為模型組和對照組，每組各30只。采用非氣管滴注染塵法建立大鼠矽肺模型，分別于染塵后1周、2周、3周、6周、12周處死（染塵組和對照組各6只），取肺泡灌洗液、外周血和肺組織。倒置顯微鏡下觀

7、察不同時段矽肺大鼠肺組織的形態(tài)結構（HE染色），對大鼠矽肺模型進行鑒定；投射電鏡檢測肺泡內(nèi)DC對SiO2粉塵的吞噬。流式細胞術檢測肺泡灌洗液中DC、Th1、Th2細胞數(shù)量變化和外周血中DC的數(shù)量分布變化；Polymer雙色免疫組織化學染色法檢測肺組織中同部位 DC（OX62+細胞）和AM（CD68+細胞）的數(shù)量與分布；ELISA法檢測肺組織中Th1、Th2型細胞因子IL-4和IFN-γ的表達。另選10只SD大鼠，將活細胞熒光標記染料（C

8、arboxyfluorescein succinimidyl amino ester，CFSE）標記的DC通過尾靜脈注射進入大鼠體內(nèi)，然后立即非氣管滴注染塵法對大鼠進行SiO2粉塵暴露，于染塵3周后處死，流式細胞術檢測肺泡灌洗液中CFSE+DC占總DC的比例。⑶運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和分析，結果以?±s表示，兩組間均數(shù)比較采用Student’s t檢驗，重復測量采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析，多組間的比較采用單因素

9、方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗，檢驗水準α=0.05。
　　結果：①通過細胞因子聯(lián)合誘導體外培養(yǎng)的大鼠外周血單核細胞12d后，顯微鏡下可觀察到DC形成眾多的細胞集落，細胞表面有大量的皺褶和突起，細胞內(nèi)有豐富的細胞器和少量的空泡；DC的熒光微球吞噬率、DC細胞表型分子CD80、CD86、MHC II和分泌的細胞因子IL-12p70、IL-18均在第12天達到較高水平，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。②SiO2粉塵染毒后，D

10、C和AM的細胞存活率均隨著 SiO2粉塵濃度的增高而降低，相同染毒濃度下隨著染毒時間延長而降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。SiO2粉塵染毒12h后，80、100、120、140μg/ml劑量下DC的細胞存活率高于AM，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；SiO2粉塵染毒24h和48h后，20、40、60、80、100、120、140μg/ml劑量下DC的細胞存活率高于AM，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。③電鏡下觀察到DC

11、可以胞吞的形式吞噬SiO2粉塵，吞噬SiO2粉塵后細胞體積變大出現(xiàn)嚴重腫脹，表面的褶皺變淺或消失，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡，細胞器減少，所吞噬的SiO2粉塵主要位于 DC細胞空泡內(nèi)。與對照組相比，直接暴露組 DC對熒光微球的吞噬率下降，間接暴露組升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。與對照組和共培養(yǎng)組相比，直接暴露組和間接暴露組DC表型分子CD80、CD86、MHC II的表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。直接暴露組 DC

12、中 IL-12、IL-18和TLR4、TLR9、Myd88、NFκB mRNA和蛋白的表達水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；間接暴露組 DC中 IL-12、IL-18和TLR4、TLR9、Myd88、NFκB mRNA和蛋白的表達水平均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。直接暴露組 DC中IL-12、IL-18和TLR4、TLR9、Myd88、NFκB mRNA和蛋白的表達水平高于間接暴露組，差異具有統(tǒng)計

13、學意義（P＜0.05）。SiO2粉塵暴露后的DC與T細胞共培養(yǎng)后，CFSE熒光標記的T細胞會被直接暴露組和間接暴露組的DC吞入胞內(nèi)，與對照組相比，T細胞存活數(shù)量減少；Th2細胞比例增高，Th1細胞比例下降，Th1/Th2比值降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。④光鏡下可見染塵1、2周的大鼠肺泡腔有大量的炎性細胞聚集，肺間隔增寬；染塵3周時肺組織中出現(xiàn)眾多的細胞性結節(jié)，結節(jié)周圍有明顯的炎性細胞浸潤；染塵6周時有大量的細胞性結節(jié)和纖維

14、性結節(jié)形成，結節(jié)間出現(xiàn)融合并形成大的結節(jié)；染塵12周時肺組織中可見大量纖維性結節(jié)，出現(xiàn)肺間隔斷裂和肺泡融合。電鏡下可見染塵3周時大鼠肺泡內(nèi)的DC吞噬有SiO2粉塵，吞噬后的SiO2粉塵位于細胞空泡內(nèi)，細胞質嚴重空泡化，細胞表面變得光滑，細胞器減少或消失，大部分空泡發(fā)生破裂融合。⑤隨著染塵時間延長，大鼠外周血 CD80+DC、MHC II+DC比例逐漸增高，CD80+DC比例在2周時最高，MHC II+DC比例在3周時最高；與對照組相比，

15、2、3、6、12周 CD80+DC、MHC II+DC比例增高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。隨著染塵時間延長，大鼠肺泡灌洗液中OX62+DC的比例呈增高趨勢，3周時達峰值。染塵2、3、6周時比例與對照組的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。隨著染塵時間延長，大鼠肺組織的OX62表達呈先增高再降低，3周時表達最高。1、2、3、6周時表達均高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CD68表達呈先降低再增高，6周時表達最

16、低；染塵1、2、12周時表達均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。隨著染塵時間延長，各時段染塵大鼠肺泡灌洗液中 Th1細胞比例逐漸降低，Th2細胞比例逐漸增高，Th1/Th2比值逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，1、2、3周時Th1細胞比例增高，1、2周時Th2細胞比例降低、12周時增高，1、2、3周染塵大鼠肺泡灌洗液中 Th1/Th2比值增高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，1

17、周和2周染塵組大鼠肺組織中IFN-γ表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；1周染塵組大鼠肺組織中 IL-4表達降低，12周染塵組大鼠肺組織中IL-4表達增高，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。⑥與對照組相比，3周染塵矽肺大鼠肺泡灌洗液中 CFSE+DC陽性細胞占 DC比例顯著增高（P<0.01）。
　　結論：⑴DC在體外培養(yǎng)和矽肺大鼠體內(nèi)都具有直接吞噬SiO2粉塵的作用，吞噬后的SiO2粉塵位于細胞空泡內(nèi)。D